Modulation of the immune response by purinergic molecules: The ATP to adenosine axis in T cells

Abstract

Purinergic enzymes and receptors are expressed on many immune cell types and are involved in the metabolism of extracellular adenine nucleotides. Under physiological conditions, the concentration of adenosine triphosphate (ATP) in the extracellular space is low, but it can drastically increase after ATP release from cells during inflammation, cell stress or cell lysis. Extracellular ATP induces mainly pro-inflammatory signaling pathways by activating P2 receptors, including the ionotropic P2X7 receptor. ATP can be degraded to adenosine by the concerted action of the ectonucleotidases CD39 and CD73, and adenosine then induces anti-inflammatory effects by activating P1 receptors. During T lymphocyte activation, ATP and adenosine have opposing effects, and the balance between both molecules is critical for the outcome of an immune response. Manipulating purinergic pathways could be used as therapy for inflammatory diseases. This requires a detailed analysis of the expression and complex interplay of the involved enzymes and receptors on human T cells. In the work presented in this thesis, I assessed the effects of ATP signaling in human T cells, and characterized the function and regulation of enzymes involved in ATP degradation and adenosine generation. We analyzed the expression of the ATP receptor P2X7 in the human T cell compartment, and could show that P2X7 is mainly expressed on innate-like T cells. P2X7 expression renders these cells susceptible to ATP-induced Ca2+ influx and cell death. The rapid degradation of ATP to adenosine by CD39 and CD73 is a well described immune suppression mechanism, but co-expression of both ectonucleotidases on human T cells is rare. We thoroughly characterized the expression and function of both enzymes on human T cells, and found that CD73 is released on extracellular vesicles (EVs) from effector T cells upon T cell activation. EV-bound CD73 retains its enzymatic activity and mediates, especially in combination with regulatory T cells, immune suppression. Finally, we have identified murine CD73 as target for adenosine diphosphate (ADP)-ribosylation, a post-translational modification already known from the P2X7 receptor and other targets. Both the release of CD73 in EVs and the decrease of CD73 enzymatic activity through ADP-ribosylation constitute mechanisms to regulate CD73 function, and ultimately the outcome of an immune response. In summary, in my thesis I show expression patterns, regulation mechanisms, and interactions of purinergic proteins involved in ATP-induced signaling pathways and in the degradation of ATP to adenosine.

Purinerge Enzyme und Rezeptoren werden auf vielen unterschiedlichen Typen von Immunzellen exprimiert und sind an dem Metabolismus von extrazellulären Adenin-Nukleotiden beteiligt. Unter physiologischen Bedingungen ist die Konzentration von extrazellulärem Adenosintriphosphat (ATP) gering. Während Entzündungsreaktionen, Zellstress oder Zelllyse wird ATP jedoch von Zellen freigesetzt, was zu einem starken Anstieg der extrazellulären Konzentration führen kann. Extrazelluläres ATP induziert vor allem entzündungsfördernde Signalwege durch die Aktivierung von P2-Rezeptoren, einschließlich des ionotropen P2X7-Rezeptors. ATP kann durch die Ektonukleotidasen CD39 und CD73 zu Adenosin abgebaut werden, welches durch die Aktivierung von P1-Rezeptoren entzündungshemmende Signalwege einleitet. Während der Aktivierung von T-Lymphozyten haben ATP und Adenosin gegensätzliche Effekte, und das Gleichgewicht zwischen beiden Molekülen ist entscheidend für den Ausgang einer Immunantwort. Eine gezielte Modulation von purinergen Signalwegen könnte zu der Therapie von entzündlichen Erkrankungen beitragen. Dies erfordert eine detaillierte Analyse der Expression und des komplexen Zusammenspiels der beteiligten Enzyme und Rezeptoren auf humanen T-Zellen. In dieser Arbeit habe ich die Effekte von ATP-Rezeptor-vermittelten Signalwegen sowie die Funktion und Regulation von Enzymen, die an dem Abbau von ATP und der Bildung von Adenosin beteiligt sind, untersucht. Wir haben die Expression des ATP-Rezeptors P2X7 auf humanen T-Zellen analysiert und konnten zeigen, dass P2X7 vor allem auf „unkonventionellen“ T-Zellen, die Charakteristika von Zellen des angeborenen Immunsystems aufweisen, exprimiert wird. Diese Zellen werden dadurch empfänglich für den ATP-induzierten Einstrom von Ca2+-Ionen und Zelltod. Der Abbau von ATP zu Adenosin durch CD39 und CD73 ist ein Mechanismus, der zu Immunsuppression führt und in diesem Kontext gut charakterisiert ist. Auf humanen T-Zellen ist die Co-Expression beider Ektonukleotidasen allerdings selten. Wir haben die Expression und Funktion von CD39 und CD73 auf humanen T-Zellen umfassend charakterisiert und aufgezeigt, dass CD73 von aktivierten Effektor-T-Zellen auf extrazellulären Vesikeln (EVs) freigesetzt wird. Das EV-gebundene CD73 ist enzymatisch aktiv und führt, vor allem in Kombination mit regulatorischen T-Zellen, zu Immunsuppression. Abschließend haben wir herausgefunden, dass CD73 durch ADP-Ribosylierung modifiziert wird. ADP-Ribosylierung ist eine posttranslationale Modifikation, die bereits von dem P2X7-Rezeptor und anderen Proteinen bekannt ist. Sowohl die Freisetzung von CD73 auf EVs als auch die Verringerung der enzymatischen Aktivität von CD73 durch ADP-Ribosylierung stellen Mechanismen dar, die die Funktion von CD73 und letztlich den Ausgang einer Immunantwort beeinflussen. Zusammenfassend zeige ich in dieser Arbeit Expressionsmuster, Regulationsmechanismen und Interaktionen verschiedener Proteine des purinergen Systems, die an ATP-induzierten Signalwegen und an dem Abbau von ATP zu Adenosin beteiligt sind.