CRISPR-Cas9 induzierte Gen-Knockouts von Enzymen der Riboflavinbiosynthese in Prokaryoten

Abstract

Ausgangspunkt dieser Arbeit war die Entdeckung von drei HAD-Phosphatasen im Bakterium B. subtilis, die vermutlich den Missing Link in der Riboflavinbiosynthese katalysieren. Um die Rolle dieser HAD-Phosphatasen in der Riboflavinbiosynthese zu bestätigen, war es das Ziel, alle möglichen einzelnen und kombina-torischen Gen-Knockouts der drei Enzyme in B. subtilis zu erzeugen und die erhaltenen Deletionsmutanten anschließend auf eine Riboflavin- Auxotrophie zu testen. Diese umfangreichen Gen-Knockouts sollten unter Anwendung der CRISPR-Cas9 Technologie durchgeführt werden, welche hierfür zunächst im Arbeitskreis etabliert werden musste. Insgesamt wurden zwei verschiedene CRISPR-Cas9 Methoden zur Genom Editierung von Bakterien ausgewählt, um diese auf die in unserem Arbeitskreis genutzten Stämme E. coli BL21(DE3) und B. subtilis NIG1121 zu adaptieren. Die beiden etablierten CRISPR-Cas9 Methoden zeigten teilweise deutliche Unterschiede in ihrer Leistungsfähigkeit: Zwar konnten unter Anwendung von beiden Methoden hohe Mutationseffizienzen (ca. 60-75%) erzielt werden, jedoch wurden für E. coli BL21 deutliche Schwächen bzgl. der Erfolgs-quote (lediglich 50% erfolgreiche CRISPR-Cas9-Events) festgestellt. Demgegenüber waren alle in B. subtilis durchgeführten CRISPR-Cas9-Events erfolgreich. Die unterschiedlichen Beobachtungen bzgl. der Leistungsfähigkeiten der CRISPR-Cas9 Methoden in dieser Arbeit sowie die in der Literatur beschriebenen Schwierigkeiten in Bezug auf die Anwendung des CRISPR-Cas Systems in einigen Prokaryoten zeigen eindrücklich, dass weitere Studien notwendig sein werden, um umfangreiche Kenntnisse über die möglichen Einflussfaktoren zu gewinnen und eine breite Anwendung der CRISPR-Cas Technologie in industriell bzw. biomedizinisch relevanten Bakterienstämmen zu ermöglichen. Mit Hilfe der auf B. subtilis NIG1121 erfolgreich adaptierten CRISPR-Cas9 Methode konnten sowohl alle drei Einzel-deletionsmutanten der HAD-Phosphatasen als auch die verschiedenen Kombinationen der jeweiligen Doppeldeletionsmutanten sowie eine Tripledeletionsmutante molekularbiologisch erzeugt werden. Die anschließende phänotypische Charakterisierung der Klone ergab, dass alle sieben Knockout-Mutanten – auch die Tripledeletionsmutante – weiterhin in der Lage waren, ohne eine exogene Riboflavinquelle zu wachsen, was darauf hindeutet, dass es weitere Phosphatasen geben muss, welche diese Reaktion mit nennenswerten Raten katalysieren können. Mittels eines kompetitiven ELISAs wurden die intrazellulären Riboflavinkonzentrationen der jeweiligen Knockout-Klone im Vergleich zum initialen B. subtilis Stamm bestimmt. Während die Einzeldeletions-mutanten und zwei der Doppeldeletionsmutanten eine Abnahme der intrazellulärenRiboflavinkonzentrationen um 34 bis 52% zeigten, wiesen eine Doppelmutante und die Tripledeletionsmutante eine weitere Abnahme mit Ergebnissen unterhalb der Bestimmungsgrenze auf. Im Zusammenhang mit den biochemischen Untersuchungen der Deletionsmutanten wurden zudem Effekte beobachtet, welche denen einer positiven Epistasie ähneln und evtl. den Verlust der Enzym-aktivitäten, der drei HAD-Phosphatasen kompensiert haben. Auch eine mögliche Riboswitch-vermittelte Genregulation wird im Zuge der vorliegenden Ergebnisse diskutiert.