HCMV uses phase separation of UL112-113 proteins at viral genomes to facilitate viral replication

Abstract

Human cytomegalovirus (HCMV) is the leading cause of congenital infections worldwide and causes severe disease in immunocompromised patients. Upon injection of HCMV genomes into the host cell nucleus, cellular and viral factors necessary for the replication of the viral genome accumulate in membrane-less compartments called viral replication compartments (RCs). How RCs form at viral DNA and control their composition is poorly understood. Liquid-liquid phase separation (LLPS) has recently emerged as a mechanism for explaining the formation of cellular membrane-less compartments. Using live-cell imaging, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), and chemical inhibitors, we found that the essential UL112-113 proteins undergo liquid-liquid phase separation (LLPS) and form membrane-less compartments in both transfected as well as infected cells. We observed biophysical differences between the pre-replication (PRC) and the replication compartments (RC), suggesting a phase transition induced after the initiation of the DNA replication. UL112-113 LLPS was independent of other viral factors as purified proteins could phase separate and form droplets in vitro. Indeed, using a photo-inducible oligomerization domain, we showed that clustering the intrinsically disordered regions (IDRs) of UL112-113 was sufficient to induce phase separation. Using cells stably expressing UL112-113, we found that exogenous DNA reduced the local concentration threshold for UL112-113 droplet formation, suggesting that DNA can serve as a scaffold for UL112-113 clustering. We used click-chemistry and nucleoside analogs to visualize the viral genome and distinguish between the incoming and the replicating one. Interestingly, most of the incoming viral genomes localized with UL112-113 compartments in infected cells, and this association was essential for viral DNA replication. We further show that the viral polymerase accessory unit UL44 is recruited into UL112-113 droplets through its C-terminal IDR. Consequently, perturbation of UL112-113 LLPS abrogated UL44 recruitment and blocked the formation of mature replication compartments. In summary, our data suggest that HCMV uses genome-triggered local LLPS to cluster UL112-113 proteins at viral genomes, thereby generating phase-separated compartments that facilitate viral DNA replication by recruiting essential factors.

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist weltweit die Hauptursache für kongenitale Infektionen und verursacht schwere Erkrankungen bei immungeschwächten Patienten. Nach der Injektion von HCMV-Genomen in den Zellkern der Wirtszelle sammeln sich zelluläre und virale Faktoren, die für die Replikation des viralen Genoms erforderlich sind, in membranlosen Kompartimenten an, die als virale Replikationskompartimente (RCs) bezeichnet werden. Wie sich die RKs an der viralen DNA bilden und ihre Zusammensetzung kontrollieren, ist kaum bekannt. In jüngster Zeit hat sich die Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) als ein Mechanismus für die Bildung von membranlosen Zellkompartimenten herauskristallisiert. Mit Hilfe von Live-Cell-Imaging, Fluoreszenzerholung nach Photobleichung und chemischen Inhibitoren konnten wir feststellen, dass die essentiellen viralen UL112-113-Proteine eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) durchlaufen und membranlose Kompartimente sowohl in transfizierten als auch in infizierten Zellen bilden. Wir beobachteten biophysikalische Unterschiede zwischen den Kompartimenten vor der DNA-Replikation (PRCs) und der Replikation (RCs), was auf eine Veränderung der biophysikalischen Eigenschaften nach dem Beginn der DNA-Replikation hindeutet. UL112-113 LLPS war unabhängig von anderen viralen Faktoren, da gereinigte Proteine in vitro eine Phasentrennung vornehmen und Tröpfchen bilden konnten. Durch die Verwendung einer photoinduzierbaren Oligomerisierungsdomäne konnten wir zeigen, dass die Konzentrierung der intrinsisch ungeordneten Regionen (IDRs) von UL112-113 ausreicht, um eine Phasentrennung zu bewirken. Bei der Verwendung von Zellen, die UL112-113 stabil exprimieren, konnten wir feststellen, dass exogene DNA die lokale Konzentrationsschwelle für die Bildung von UL112-113-Tropfen senkt, was darauf hindeutet, dass DNA als Gerüst für die UL112-113-Clusterbildung dienen kann. Wir verwendeten Click-Chemie und Nukleosidanaloga, um das virale Genom sichtbar zu machen und zwischen den frisch injizierten und den replizierenden Genomen zu unterscheiden. Interessanterweise lokalisierten die meisten eingehenden viralen Genome mit UL112-113-Kompartimenten und diese Assoziation war für die virale DNA-Replikation essentiell. Wir konnten außerdem zeigen, dass die virale Polymerase-Einheit UL44 über ihre C-terminale IDR in UL112-113-Tröpfchen rekrutiert wird. Folglich führte eine Störung von UL112-113 LLPS zu einer Aufhebung der UL44-Rekrutierung und blockierte die Genomreplikation. Zusammenfassend legen unsere Daten nahe, dass HCMV Genom-ausgelöste lokale LLPS nutzt, um UL112-113-Proteine an viralen Genomen zu clustern und dadurch phasengetrennte Kompartimente zu erzeugen, die die virale DNA-Replikation durch die Rekrutierung wesentlicher Faktoren erleichtern.