Inhibition of the AIM2 inflammasome and pyroptosis by murine cytomegalovirus

Abstract

Programmed cell death (PCD) plays an important role in the host defense against viruses. Cytomegaloviruses (CMVs) possess the ability to expertly manipulate cellular defenses and harbor potent inhibitors of apoptosis and necroptosis. However, there is no known CMV inhibitor for pyroptosis, which is the third major form of PCD. The AIM2 inflammasome is a sensor of double-stranded DNA (dsDNA) that is activated by DNA viruses such as murine cytomegalovirus (MCMV). Inflammasome assembly induces proteolytic activation of Caspase-1 and maturation of pro-inflammatory cytokines interleukin 1β (IL-1β) and IL-18. Activated Caspase-1 can also cleave Gasdermin D (GSDMD) leading to pyroptosis. While inflammasome activation and signaling are well studied, much less is known about viral countermeasures and their importance for viral infection in vivo. In my thesis project, I searched for an MCMV inhibitor of the AIM2 inflammasome. I identified the viral M84 protein as an inhibitor of the inflammasome signaling that interacted with the DNA sensor AIM2 and the adaptor protein ASC. I could show that an M84stop MCMV mutant unable to express this protein caused increased Caspase-1 activation and IL-1β and IL-18 secretion in infected macrophages. Furthermore, M84stop MCMV was able to enhance GSDMD cleavage and pyroptotic cell death in macrophages. These effects resulted in a significant growth defect of the M84stop MCMV mutant in WT macrophages, which was rescued by knockout of either Aim2 or Asc or by treatment with a Caspase-1 inhibitor, suggesting that M84 modulates AIM2 inflammasome to optimize viral replication in vitro. The biological impact of M84 was further investigated by in vivo experiments, showing that M84 modulated IL-18 release in the serum and was required for efficient viral dissemination to the spleen and liver. The attenuation of M84stop MCMV in infected WT mice was partially rescued in Asc knockout mice, indicating that M84 may have other functions. Altogether, these results demonstrate that the inhibition of the inflammasome-pyroptosis pathway is important to facilitate MCMV replication and dissemination in vivo. This study provides the first evidence for MCMV suppressing AIM2-inflammasome-dependent pyroptosis to overcome innate immune sensing of viral DNA.

Der programmierte Zelltod (PCD) spielt eine wichtige Rolle bei der Wirtsabwehr gegen Viren. Cytomegaloviren (CMV) besitzen die Fähigkeit, die zelluläre Abwehr geschickt zu manipulieren und verfügen über potente Inhibitoren der Apoptose und Nekroptose. Es ist jedoch noch kein CMV-Inhibitor für die Pyroptose bekannt, die die dritte Hauptform des PCD darstellt. Das AIM2-Inflammasom ist ein Sensor für doppelsträngige DNA (dsDNA), der durch DNA-Viren wie das murine Cytomegalovirus (MCMV) aktiviert wird. Die Aktivierung des Inflammasoms führt zur proteolytischen Aktivierung der Caspase-1 und zur Aktivierung der proinflammatorischen Zytokine Interleukin 1β (IL-1β) und IL-18. Die aktivierte Caspase-1 kann außerdem Gasdermin D (GSDMD) spalten, was zur Pyroptose führt. Während die Inflammasom-Aktivierung und -Signalübertragung gut erforscht sind, ist über die viralen Gegenmaßnahmen und ihre Bedeutung für die virale Infektion in vivo viel weniger bekannt. Im Rahmen meines Dissertationsprojekts suchte ich nach einem MCMV-Inhibitor für das AIM2-Inflammasom. Ich identifizierte das virale Protein M84 als einen Inhibitor der Inflammasom-Signalübertragung, der mit dem DNA-Sensor AIM2 und dem Adaptorprotein ASC interagiert. Ich konnte zeigen, dass eine M84stop-MCMV-Mutante, die dieses Protein nicht exprimieren kann, eine erhöhte Caspase-1-Aktivierung sowie IL-1β- und IL-18-Sekretion in infizierten Makrophagen verursacht. Des Weiteren war M84stop-MCMV auch in der Lage, die Spaltung von GSDMD und den pyroptotischen Zelltod in Makrophagen zu verstärken. Diese Effekte führten zu einem signifikanten Wachstumsdefekt der M84stop-MCMV-Mutante in WT-Makrophagen, der durch Knockout von Aim2 oder Asc oder durch Behandlung mit einem Caspase-1-Inhibitor behoben werden konnte. Dies deutet darauf hin, dass M84 das AIM2-Inflammasom moduliert, um die virale Replikation in vitro zu optimieren. Die biologischen Auswirkungen von M84 wurden durch in-vivo-Experimente weiter untersucht. Dabei zeigte sich, dass M84 die Freisetzung von IL-18 ins Serum modulierte und für eine effiziente Verbreitung des Virus in Milz und Leber erforderlich war. Die Abschwächung von M84stop-MCMV in infizierten WT-Mäusen konnte in Asc-Knockout-Mäusen nur teilweise wiederhergestellt werden, was darauf hindeutet, dass M84 weitere Funktionen haben könnte. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Hemmung des Inflammasom-Pyroptose-Wegs wichtig ist, um die MCMV-Replikation und -Verbreitung in vivo zu fördern. Diese Studie liefert den ersten Beweis dafür, dass MCMV die AIM2-Inflammasom-abhängige Pyroptose unterdrückt, um die Erkennung viraler DNA durch das angeborene Immunsystem zu überwinden.