Modeling of LMNA-cardiomyopathy in human iPSC- derived engineered heart tissue for testing novel therapies

Abstract

The two isoforms lamin A and C, A-type lamins, encoded by the gene LMNA via alternative splicing, are located at the inner nuclear membrane, and play pivotal roles in shaping the mechanical properties of the nucleus, in regulating gene expression and sensing and responding to extracellular mechanical cues. Given the complex roles of A-type lamins, mutations can cause a diverse picture range of affected tissues, phenotypes and molecular consequences, very often accompanied by a severe form of dilated cardiomyopathy (DCM). The broad range of molecular consequences makes a causative therapy for DCM challenging, leaving heart transplantation the only option at end-stage of the disease. Here, we investigated in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) engineered heart tissues (EHTs) the functional and molecular consequences of (i) a heterozygous missense LMNA mutation (p.H222P) and (ii) a homozygous premature stop-codon resulting in complete LMNA knockout (LMNA-KO). (iii) A lamin A gene replacement therapy (AAV6-pCMV-GFP-2A-cLMNA) was tested in the LMNA-KO EHT model.

P.H222P hiPSCs revealed an instable cardiac differentiation capacity compared to IsoC hiPSCs. Successful differentiated CMs of p.H222P casted to EHTs revealed shorter relaxation time and a tendency towards lower force development than IsoC. Contractile function further deteriorated in p.H222P upon acute afterload enhancement (AE), but not in IsoC EHTs. The transcriptomic profile was altered in p.H222P EHTs and further exaggerated by AE. Interestingly, p.H222P showed a much larger gene expression response to AE than IsoC, suggesting a mechanical coupling defect as a putatively global pathogenic mechanism.

The LMNA-KO EHT model revealed a severe, time-dependent functional phenotype including marked force deterioration. Relaxation time, contraction velocity, contractile force and resting length were also significantly altered. Cellular and nuclear integrity as well as tissue remodelling capacity were disturbed in LMNA-KO EHTs. Transcriptomic and proteomic analyses revealed alterations of typical DCM pathways and lamin interaction partners. Adeno-associated virus mediated restoration of lamin A (AAV6-pCMV-GFP-2A-cLMNA) expression and localisation in the nuclear lamina resulted in the partial rescue of the functional, structural, transcriptomic and proteomic phenotype. While parallel treatment of IsoC EHTs with AAV6-pCMV-GFP-2A-cLMNA with the same dose did not exert signs of toxicity, other series of experiments in different hiPSC lines showed evidence for a dose-dependent decrease of contractile function.

In summary, two novel laminopathy hiPSC-CM EHT models were established. (i) A heterozygous p.H222P model recapitulated a mechanical decoupling phenotype and (ii) a homozygous LMNA-KO showed severe contractile dysfunction that was partially rescued by lamin A overexpression. The p.H222P model might serve as a basis for studying the interplay of altered gene expression and mechanical stress in a human laminopathy cardiac background. Thus, this model might enable to investigate a more global underlying mechanism. The LMNA-KO model addresses the second challenge for laminopathy research, elucidating a therapeutic strategy. One third of the laminopathy patients carry a nonsense mutation resulting in a premature stop of translation and putatively in a haploinsufficiency. This model might serve as a steppingstone to test the therapeutic window and assess further cardiac toxicity of the gene replacement therapy.

Das Gen LMNA kodiert durch alternatives Spleißen die Isoformen Lamin A und C, zusammengefasst A-Typ Lamine. A-Typ Lamine befinden sich an der inneren Kernmembran und spielen eine zentrale Rolle bei der Genomorganisation, bei der Beeinflussung der mechanischen Eigenschaften des Zellkerns und bei der Weiterleitung und Reaktion auf extrazelluläre mechanische Reize. Angesichts der komplexen Rolle der A-Typ-Lamine betreffen Mutationen im Gen LMNA eine Vielzahl von Gewebetypen, welche in unterschiedlichen Phänotypen und unterschiedlichen molekularen Folgen resultieren. Dennoch gehen LMNA-assoziierte Krankheiten, so genannte Laminopathien, meistens mit einer schweren Form der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) einher. Das breite Spektrum der molekularen Folgen macht eine Therapie für LMNA assoziierte DCM schwierig, so dass im Endstadium der Krankheit meist eine Herztransplantation die einzige Option ist. Hier wurden (i) die funktionellen und molekularen Folgen einer LMNA missense Mutation (p.H222P) in aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CM) im künstlichen Herzmuskelgewebe (EHT) und im Vergleich zur isogenen Kontrolllinie (IsoC) untersucht. Darüber hinaus wurde (ii) eine Zelllinie, mit einem homozygoten vorzeitigen Stopp-Codon, das zu einem Knockout von LMNA führt (LMNA-KO) im hiPSC-CM EHT Format untersucht, und eine Lamin-A-Gentherapie in diesem Modell getestet.

Bei der Etablierung des p.H222P Laminopathie-Krankheitsmodells zeigten die hiPSCs im Vergleich zu IsoC hiPSCs eine hohe Varianz im kardialen Differenzierungsvermögen. Die erfolgreich differenzierten CMs von p.H222P wiesen im EHT-Format eine kürzere Relaxationszeit, eine Tendenz zu einer geringeren Kontraktionskraft im Vergleich zu IsoC-EHTs und Veränderungen des Aktionspotentials auf. Die kontraktile Funktion fiel bei p.H222P unter akuter Nachlasterhöhung (AE) ab, nicht aber bei IsoC-EHTs. Eine Transkriptom-Analyse zeigte, dass sich das Expressionsprofil von p.H222P EHTs stark von IsoC unterschied. p.H222P EHTs reagierten auf eine durch erhöhte AE induzierte mechanische Belastung deutlich stärker mit einer Veränderung der Genexpression als IsoC. Die Ergebnisse sprechen zusammengenommen für einen Defekt der mechanischen Kopplung, welcher mutmaßlich als globaler pathogener Mechanismus in diesem Laminopathie Modell und darüber hinaus verstanden werden kann.

Das LMNA-KO-EHT-Modell zeigte im Vergleich zu p.H222P einen schwereren funktionellen Phänotyp auf, der zu einem zeitabhängigen Einbruch in der Kontraktionskraft führte. Die Relaxationszeit, die Kontraktionsgeschwindigkeit, die Kontraktionskraft und die Ruhelänge waren alle samt signifikant verändert. Das Fehlen der A-Typ-Lamine führte zu fehlender zellulärer und nukleärer Integrität sowie einer eingeschränkten Fähigkeit zum Remodelling im EHT. Die Expression von typischen DCM-Signalwegen und Lamin-Interaktionspartnern war in der Transkriptom- und Proteom-Analyse in LMNA-KO-EHTs verändert. Die durch ein Adeno-assoziiertes Virus vermittelte Expression von Lamin A führte zu einem Einbau von Lamin A in die Kernmembran und einer teilweisen Verbesserung des funktionellen und strukturellen Phänotyps, sowie partiell des Transkriptoms und Proteoms. Während die parallele Behandlung von IsoC-EHTs mit AAV6-pCMV-GFP-2A-cLMNA bei gleicher Dosis keine Anzeichen von Toxizität aufwies, zeigten andere Versuchsreihen in verschiedenen hiPSC-Linien Hinweise auf eine dosisabhängige Abnahme der kontraktilen Funktion.

Zusammengefasst wurden zwei neue Laminopathie-hiPSC-CM-EHT-Modelle etabliert: (i) EHTs mit einer heterozygoten p.H222P Mutation wiesen Zeichen einer mechanischen Entkopplung als grundlegenden Krankheits-Phänotyp auf, und (ii) EHTs mit einem homozygoten LMNA-KO zeigten eine schwere kontraktile Dysfunktion, die durch exogene Lamin-A-Expression teilweise behoben werden konnte. Das p.H222P-Modell kann als Grundlage für die Untersuchung des Zusammenspiels von veränderter Genexpression und mechanischer Belastung im humanen kardialen Laminopathie-Kontext dienen. Dieses Modell könnte es ermöglichen, einen globaleren zugrunde liegenden Mechanismus zu ermitteln. Das LMNA-KO-Modell stellt die Basis für die Untersuchung der zweiten Herausforderung für die Laminopathie-Forschung, der Ermittlung einer therapeutischen Strategie, dar. Ein Drittel der Laminopathie-Patienten trägt eine nonsense Mutation, die zu einem vorzeitigen Translationsstopp und dadurch vermutlich zu einer Haploinsuffizienz führen. Dieses Modell könnte als erster Ansatz für die Ermittlung eines therapeutischen Fensters und die Testung kardialer Toxizität der Genersatztherapie dienen.