The Role of SMARCA4 in the Development of WNT and Group 3 Medulloblastoma

Abstract

SMARCA4 is a catalytic subunit of the BAF (BRG1/BRM-associated factor) chromatin remodeling complex, which acts as a regulator of chromatin accessibility and gene expression in mammals. Alterations of SMARCA4 are frequently detected in medulloblastoma (MB), the most common malignant pediatric brain tumor. MB can be divided into the four molecular subgroups Sonic Hedgehog (SHH), Wingless/Int-1 (WNT), Group 3, and Group 4, of which mainly WNT and Group 3 MB are affected by SMARCA4 mutations. However, the functional role of these alterations in tumorigenesis has not been deciphered yet. Therefore, we designed lentiviral constructs for the overexpression of mutant SMARCA4 variants to assess effects on cell viability in vitro. Additionally, we combined a knockdown of SMARCA4 with subgroup-specific alterations of WNT and Group 3 MB in two different mouse models.

In our in vitro approach, we transduced three MB cell lines and primary murine granule cell precursors (GCPs) with mutant SMARCA4 variants T910M and R1135W. Both variants were previously identified in MB patients and are known to induce a loss of function. We successfully demonstrated functionality of our plasmids. However, overexpression of SMARCA4 wildtype and mutant variants did not influence viability of cell lines or primary cells in vitro.

In a next step, we successfully generated a SMARCA4-deficient MB mouse model by combining an overexpression of MYC with a loss of SMARCA4 in GCPs in vitro with subsequent transplantation into immunodeficient mice. Tumors developed in 5 out of 19 mice with a high resemblance to Group 3 MB in both gene expression and DNA methylation analysis. SMARCA4 loss was evident in all tumor cells, suggesting a dependency of tumor growth on the Smarca4 alteration.

Lastly, we modified a previously published WNT MB mouse model by combining a mutation in the β-catenin gene Ctnnb1 with a loss of SMARCA4 in Blbp-cre::Ctnnb1(ex3)fl/wt::Smarca4fl/fl mice. The combination of both alterations resulted in perinatal lethality of mice. However, we detected proliferative cerebellar lesions at embryonic age, which suggest a cooperative effect of altered WNT signaling and SMARCA4 loss in driving cell transformation. We thoroughly analyzed these lesions both histologically and on a molecular level by DNA methylation analysis and single-cell RNA sequencing analysis. Our results indicate an origin in early SOX2-positive cerebellar progenitors.

Taken together, these results provide evidence for a tumor-driving role of SMARCA4 alterations in both MYC-driven MB as well as in cooperation with aberrant WNT signaling.

SMARCA4 ist eine katalytische Untereinheit des BAF (BRG1/BRM-assoziierter Faktor) Chromatin Remodeling Komplexes, welcher die Zugänglichkeit von Chromatin und somit auch die Genexpression in Säugetieren reguliert. Obwohl Medulloblastome (MB), die häufigsten malignen pädiatrischen Hirntumore, oft von Mutationen im SMARCA4 Gen betroffen sind, verbleibt die funktionelle Rolle dieser Alterationen bislang unklar. Von den vier molekularen MB-Subgruppen (Wingless/Int-1 (WNT), Sonic Hedgehog (SHH), Gruppe 3 und Gruppe 4) weisen vor allem WNT und Gruppe 3 MB häufig SMARCA4 Mutationen auf. Innerhalb dieses Projekts untersuchten wir Effekte dieser Mutationen zunächst durch die Überexpression von SMARCA4 Varianten in vitro. Zusätzlich kombinierten wir einen Knockdown von SMARCA4 mit Subgruppen-spezifischen Alterationen von WNT und Gruppe 3 MB in zwei unabhängigen Mausmodellen.

Insgesamt transduzierten wir drei MB-Zelllinien und primäre murine Körnerzellvorläufer mit den mutierten SMARCA4 Varianten T910M und R1135W. Beide Varianten wurden zuvor in MB-Patienten identifiziert und führen zu einem Funktionsverlust des Proteins. Trotz erwiesener Funktionalität unserer Konstrukte konnten wir keinen Einfluss von Wildtyp oder mutiertem SMARCA4 auf die Viabilität von Zelllinien oder primären Zellen in vitro feststellen.

In unserem ersten in vivo Ansatz generierten wir ein SMARCA4-defizientes MB-Mausmodell, indem wir eine Überexpression von MYC mit einem Verlust von SMARCA4 in Körnerzellvorläufern kombinierten. Nach Transplantation in immundefiziente Mäuse entwickelten 5 von 19 Tieren Tumoren, deren DNA-Methylierung und Genexpressionsprofile große Ähnlichkeiten zu Gruppe 3 MBs aufzeigten. Der Verlust von SMARCA4 in allen Tumorzellen wies auf eine Abhängigkeit der Tumorentwicklung von der eingebrachten Smarca4 Veränderungen hin.

Schlussendlich modifizierten wir ein zuvor publiziertes WNT MB Mausmodell, indem wir eine Mutation im β-Catenin Gen Ctnnb1 mit einem SMARCA4 Verlust in Blbp-cre::Ctnnb1(ex3)fl/wt::Smarca4fl/fl Mäusen kombinierten. Diese Tiere waren nicht lebensfähig, entwickelten jedoch im embryonalen Alter große proliferative Läsionen im Kleinhirn. Dies suggeriert einen kooperativen Effekt des aktivierten WNT-Signalwegs mit einem Verlust von SMARCA4 in der Transformation von Zellen. Eine ausgiebige Charakterisierung der Histologie, DNA Methylierung und Einzelzell-Genexpression in den Läsionen deutete auf einen Ursprung in SOX2-positiven zerebellären Vorläufern hin.

Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Studien neue Hinweise auf einen tumortreibenden Effekt von SMARCA4 Veränderungen sowohl in MYC-getriebenen MB als auch in Kooperation mit einer Überaktivierung des WNT-Signalwegs.