Identifikation und Charakterisierung von ABCB Transportern im Blattkäfer Chrysochus asclepiadeus (Coleoptera, Chrysomelidea, Eumolpinae)

Abstract

In der Blattkäfergattung Chrysochus haben sich die nordamerikanischen Vertreter C. auratus und C. cobaltinus auf Cardenolid-produzierende Apocynaceae spezialisiert. Die europäische Art C. asclepiadeus hingegen ernährt sich von Vincetoxicum spp., einer Apocynaceae Art, die keine Cardenolide produziert. Cardenolide sind toxische sekundäre Pflanzenmetabolite, die die Natrium-Kalium-ATPase (Na,K-ATPase) blockieren. Insekten, die sich auf Cardenolid-produzierende Pflanzenarten spezialisiert haben, haben verschiedene Anpassungsmechanismen entwickelt. Bereits gut untersucht wurde die target-site insensitivity, bei der die Sensitivität der Na,K-ATPase durch Aminosäuresubstitutionen herabgesetzt wird. Diese Anpassung geht oft mit der Sequestration von Cardenoliden einher, die als selektive Aufnahme, Transport, Modifikation, (Ein-)Lagerung und der Einsatz der sekundären Pflanzenmetabolite zur eigenen Verteidigung beschrieben wird. Dabei ist der genaue Transportmechanismus noch unbekannt. Allgemein können apolare Cardenolide Membranen passiv überqueren, polare Cardenolide können nur über den parazellulären Transport oder durch Carrier-Mechanismen transportiert werden. Das apolare Cardenolid Digoxin gilt als Substrat für ABCB1-Proteine bei Insekten und Vertebraten. ABCB-Transporter gehören zur ATP-Binding-Cassette -Superproteinfamilie (ABC-). Die ABC-Proteine kommen in allen Bereichen des Lebens vor. Die Mehrheit der ABCB-Proteine fungiert als Efflux Transporter und transportiert eine Vielfalt von Substraten unter dem Verbrauch von Adenosintriphosphat (ATP) über die Zellmembranen. Jeder funktionale Transporter besteht aus zwei stark konservierten Nukleotidbindedomänen (NBD) und zwei Transmembrandomänen (TMD). Aufgrund der stark konservierten Bereiche der NBD kann die ABC-Proteinsuperfamilie in Arthropoden in neun Unterfamilien (A-I; I nur in Anopheles) unterteilt werden. Die Unterfamilie B steht vor allem im Zusammenhang mit dem Transport von Xenobiotika. Bisher wurden drei verschiedene ABCB-Transporterproteine mit einem substratspezifischen Aktivitätsspektrum gegenüber Cardenoliden und Gewebe-spezifischer Expression im C. auratus identifiziert. Da in C. auratus eine eindeutige Interaktion der ABCB Transporter mit Cardenoliden vorliegt, sollten die ABCB-Transporter in der nicht auf Cardenolid-haltigen Pflanzen fressenden Art C. asclepiadeus identifiziert und charakterisiert werden, um so die mögliche Evolution der Sequestration im Genus näher beschreiben zu können und zu untersuchen inwieweit sich die Transporterspezifität durch den Cardenolidgehalt in den Wirtpflanzen verändert hat. Über bioinformatische Methoden (tblastx und ABC-Scan) konnte ich insgesamt 45 mögliche ABC-Proteine im Transkriptom von C. asclepiadeus identifizieren. C. asclepiadeus besitzt zwei ABCB-Volltransporter und vier Halbtransporter, die die charakteristischen Motive (Walker A, Walker B, ABC-Signatur und die Epitope des spezifischen C219-Antikörpers) und die typische Proteinstruktur besitzen. Die phylogenetische Untersuchung zeigte, dass beide ABCB-Transporter innerhalb der Coleoptera gruppierten und sich in die beiden Untergruppen ABCB1 und ABCB2/ ABCB3 aufteilen. Die ABCB1-Proteine von C. auratus und C. asclepiadeus sind homolog zueinander, während der zweite C. asclepiadeus ABCB-Transporter zu den ABCB2- und ABCB3-Proteinen von C. auratus gleich nah verwandt ist. Dies könnte auf eine Genduplikation in C. auratus als Anpassung an die Aufnahme von Cardenoliden in der Nahrung hindeuten. Beide C. asclepiadeus ABCB-Transporter weisen ein Gewebe-spezifisches Expressionsmuster auf, was auf verschiedene Funktionen innerhalb des Organismus hinweist. CascABCB1 wird am stärksten im Nervengewebe exprimiert und ist überall außer in den Malpighischen Gefäßen stärker als CascABCB2 exprimiert. Die starke Expression im Nervensystem lässt auf eine Schutzfunktion gegenüber Xenobotika schließen. Die nächsthöheren Expressionen sind in den Elytren und dem Darm von ABCB1 zu finden, was den Transport des Wehrsekrets des C. asclepiadeus gewährleisten könnte. CascABCB2 wird am stärksten in den Malpighischen Gefäßen exprimiert, was eine Rolle für eine schnelle Exkretionsfunktion nahelegt. Beide C. asclepiadeus ABCB-Transporterproteine konnten erfolgreich in Sf9-Insektenzellen exprimiert werden. Die erwartete Lokalisation in den Zellmembranen konnte durch den spezifischen Antikörper C219 nachgewiesen werden und nach anschließender Isolation im Western-Blot die erwartete Länge von ~130 kDa detektiert werden. Anschließend wurde das Substratspektrum der beiden C. asclepiadeus ABCB-Transporterproteine durch einen ATPase-Aktivitäts-Assay unter Verwendung von Verapamil sowie Digoxin, Cymarin, Ouabain und Calotropin bestimmt. Die beiden ABCB-Transporter zeigten den erwarteten glockenförmigen Verlauf, der durch eine konzentrationsabhängige Stimulation durch Verapamil verursacht wurde. CascABCB1 wurde jedoch durch keines der getesteten Cardenolide stimuliert. CascABCB2 wurde dagegen leicht durch Digoxin und stärker durch Ouabain stimuliert. Die geringe Genexpression und geringe bis fehlende ATPase-Aktivität der beiden C. asclepiadeus ABCB-Transporterproteine im Vergleich zu C. auratus deuten darauf hin, dass diese keine Cardenolide transportieren können. Es könnte sich um einen sekundären Verlust handeln, der durch den Wechsel auf Pflanzen ohne Cardenolide entstanden ist.