Characterisation of photo-switching in fluorescent molecules at low temperatures

Abstract

Die superauflösende Mikroskopie (SRM) ermöglicht die Erzeugung von lichtmikroskopischen Bildern unterhalb der Beugungsgrenze. Um biologische Strukturen mit höchster räumlicher Auflösung untersuchen zu können, müssen sie immobilisiert werden, damit sie sich während der Datenerfassung nicht bewegen. Klassische chemische Fixierungsmethoden sind weit verbreitet, können aber zu strukturellen Artefakten führen. Im Gegensatz dazu erreichen Kryo-Immobilisierungsmethoden eine Strukturerhaltung in einem nahezu natürlichen Zustand. Vitrifikation, eine Immobilisierungsmethode, in der die Proben so schnell eingefroren werden, dass die Wassermoleküle keine kristalline Struktur ausbilden können, wurde bereits erfolgreich eingesetzt, um Proben für die Elektronenkryomikroskopie in einem nahezu nativen Zustand zu immobilisieren. Dies eröffnet den Weg zum Kryo-SRM. Obwohl es bereits erfolgreiche Versuche im Kryo-SRM gibt, sind die zugrundeliegenden photophysikalischen Prozesse bei niedrigen Temperaturen anders als bei Umgebungstemperatur und weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurden verschiedene organische Fluoreszenzfarbstoffe auf ihre Eignung für Kryo-SRM untersucht. Es wurde festgestellt, dass alle untersuchten Farbstoffe Fluoreszenzfluktuationen im Zeitbereich von 10 Millisekunden aufweisen, die mit Hilfe der kryogenen superauflösenden optischen Fluktuationsbildgebung (cryo-SOFI) für eine bis zu dreifache Auflösungsverbesserung genutzt werden können. Darüber hinaus wurden Fluoreszenzunterbrechungen bei längeren Zeitspannen beobachtet, die für die kryogene Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (cryo-SMLM) verwendet werden können, was zu einer räumlichen Auflösungverbesserung auf 10-20nm führt. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein und derselbe Farbstoff für unterschiedliche Auflösungsverbesserungen verwendet werden kann, je nachdem, wie er zwischen einem fluoreszierenden und mehreren nicht fluoreszierenden Zuständen wechselt.

Super-resolution microscopy (SRM) enables the generation of light microscopy images below the diffraction limit. To study biological structures with highest spatial resolution, they have to be immobilized to avoid movement during data acquisition. Classical chemical fixation methods are widespread but can lead to structural artefacts. On the contrary, cryo-immobilization methods achieve structural preservation in a near-native state. Fast freezing techniques (vitrification) are already successfully used to immobilized samples in a near-native state for electron cryo-microscopy. This opens up the path to cryo-SRM. Even though there are already successful attempts in cryo-SRM the underlying photo-physical processes at low temperature are different from ambient temperature and largely unknown. In this thesis several fluorescent organic dyes are investigated for their suitability for cryo-SRM. It was found that all investigated dyes show fluorescence fluctuation in the 10 millisecond time range which can be used by cryogenic superresolution optical fluctuation imaging (cryo-SOFI) for a resolution enhancement of up to threefold. Furthermore, fluorescence intermittence at longer time ranges was observed, which can be used for cryogenic single molecule localization microscopy (cryo-SMLM) leading to a spatial resolution of 10-20 nm. These findings show that one dye can be used for different resolution enhancements depending on their mode of switching between the fluorescent state and non-fluorescent state(s).