Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus Oximen und Dephostatin-Derivaten

Abstract

Diese Arbeit behandelt im Wesentlichen die Untersuchung der NO-Freisetzung aus Oximen. Der mögliche Einfluss von Cytochrom P450 auf diese Freisetzung wurde durch ein in unserem Arbeitskreis bereits etabliertes biomimetisches Modellsystem, bestehend aus einem niedermolekularen Metall-Porphyrin-Komplex und Iodosobenzol als Sauerstoffdonor, imitiert. Die Quantifizierung der freigesetzten NO-Mengen erfolgte mit Hilfe der bis in den picomolaren Konzentrationsbereich empfindliche Chemilumineszenzmethode. Die NO-Freisetzung aus den in dieser Studie untersuchten Oximen kann sehr unterschiedlich ausfallen. Sie hängt nicht nur von den äußeren Bedingungen, sondern auch sehr von dem molekularen Aufbau ab. Folgende strukturelle Aspekte spielen bei der NO-Freisetzung aus diesen Hydroxyimino-Verbindungen eine Rolle: • Die NO-Bildung aus Ketoximen kann im Gegensatz zu Aldoximen durch Porphyrine im neutralen Milieu gesteigert werden. • Elektronenziehende Reste können bei Benzaldehydoxim-Derivaten auch bei pH 7,4 in Porphyrin-Anwesenheit zu einer Erhöhung der Ausbeute führen. • Die gebildete NO-Menge sinkt in folgender Reihenfolge: Ketoxime > Aldoxime > cycloaliphatische Ketoxime Dafür werden neben der unterschiedlichen Mesomeriestabilität intermediär gebildeter Iminoxy-Radikale, eine durch die Struktur bedingte verbesserte Spaltbarkeit und sterische Gründe verantwortlich gemacht. Letztere bewirken die intermediäre Ausbildung eines dimerähnlichen Moleküls, welches sich sehr schnell und irreversibel zersetzt. • Elektronenschiebende Reste bewirken eine verbesserte Oxidierbarkeit, die zu erhöhter NO-Ausbeute führen kann. Es konnten dabei vier verschiedene mögliche Freisetzungsmechanismen postuliert werden, die auch parallel zueinander ablaufen können: 1. über die Hydrolyse zum NO-Donor Hydroxylamin 2. durch die Reaktion mit dem Sauerstoff-Donor 3. durch die Reaktion mit Kupfer(II)-Ionen 4. durch die katalytische Reaktion mit Porphyrinen Diese mechanistischen Vorstellungen konnten durch den kolorimetrischen Hydroxylamin-Nachweis, den DC-Nachweis der entsprechenden Carbonylverbindung am Beispiel von FLOX, sowie die Untersuchung des Nitroxyl-Donors Angelis Salz mit Hilfe der Fluorimetrie und Chemilumineszenzmethode bestätigt werden. Des Weiteren tragen diverse Untersuchungen in vorangegangenen Arbeiten in unserem Arbeitskreis, sowie zahlreiche Angaben in der Literatur zur Bekräftigung dieser Reaktionsvorschläge bei. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen bestätigen nicht nur die These, dass der NO-Donor Hydroxylamin intermediär Nitroxyl-Anionen bildet. Zusätzlich deuten sie an, dass dieses Intermediat bei der NO-Freisetzung aus Oximen, die sich nach den Mechanismen 1.-3. zersetzen, ebenfalls gebildet wird. Lediglich durch die Porphyrin-katalysierte Reaktion (4.) kommen NO- zwischenzeitlich nicht vor. Frühere Untersuchungen an verschiedenen Hydroxyimino-Verbindungen zeigten, dass all diese NO über die intermediäre Bildung von Hydroxylamin bilden. Dieses konnte im Rahmen dieser Arbeit nur für einige Oxime gezeigt werden. Dieser Aspekt ist in Hinblick auf die Hämotoxizität bisher untersuchter Oxime wichtig, da diese von einer Hydrolyse im Blut herrühren soll. Der Vergleich der Chemilumineszenzbestimmung von Angelis Salz, Hydroxylamin und FLOX (beispielhaft für die Oxime) zeigt, dass die Oxidation zu Nitrit nicht nur vom Stickstoffmonoxid sondern auch von NO- aus geht. Dabei scheint der elektronische Zustand eine wichtige Rolle zu spielen. Singulett-Nitroxyl scheint in Gegenwart des Iodosobenzols eher zu Nitrit zu reagieren als zu NO. Bei Triplett-Nitroxyl entsteht unter diesen Bedingungen mehr Stickstoffmonoxid. Kupfer(II)-Ionen reagieren mit beiden Nitroxyl-Varianten nur bis zum NO. Des Weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit die Stickstoffmonoxid-Freisetzung anhand bis dato nicht als NO-Donor bekannter Derivate des Protein-Tyrosin-Phosphatase-Inhibitors Dephostatin gezeigt und untersucht werden. Die Erhöhung der NO-Ausbeute aus diesen Substanzen durch Verwendung des biomimetischen Systems deutet dabei eine Stickstoffmonoxid-Freisetzung unter Enzymbeteiligung an. Das positive Ergebnis eines als Negativ-Kontrolle mitgeführten O-alkylierten Oxims nach Zugabe des Oxygenierungssystems, eröffnet neue Ansätze in der Anwendung unseres biomimetischen Modells.

The principal subject of this work was to investigate NO generation from oximes. To analyze whether the released amount of NO was affected by the cytochrome-P450 we used a cytochrome-P450 model system consisting of low molecular weight metal complex and iodosobenzene as oxygen donor. This system had been tried and tested. The quantification of nitric oxide was carried out by chemiluminescence method, which is sensitive down to the picomolar concentration rate. The NO-release from the compounds investigated in this study can be very variable. It does not only depend on the outside influences but also on their molecular structure. The following structural aspects play a role for the generation of nitric oxide from oximes: • The NO-release from ketoximes increases in the presence of porphyrines at the pH 7,4. The NO-release of aldoximes does not. • The yield of NO from benzaldehyde oximes enhances in the presence of porphyrines at pH 7,4 by electron poor substituents. • The generated amount decreases in the following order: ketoximes > aldoximes > cycloaliphatic ketoximes This supposed to be caused by the mesomerism stability of the iminoxy radical, the enhanced fissionability as a result of the ketoxime structure and steric reasons. The latter effects the formation of a dimer, whose decomposition is fast and irreversible. • The ability of oximes to be oxidised increases by electron rich substituents. Thereby the NO generation can be increased. We were able to postulate four distinct mechanisms suggested which can react parallel to each other: 1. NO release running over the formation of hydroxylamine. 2. reaction with iodosobenzene 3. reaction with copper(II)-ions 4. katalytical reaction with porphyrines These hypothetical mechanisms were confirmed by colorimetric determination of hydroxylamine as well as by DC-identification of the corresponding oxo-compound fluorenone. The results of the examination of the nitroxyl donor Angelis salt by flluorimetry and chemiluminescence affirmed these presumptions, too. Several bibliograrphical references as well as former investigations in our work group also contributed to the affirmation. The results of this study confirm that the hydroxylamine release NO by the production of nitroxyl. NO- seems to be the intermediate of the mechanisms 1. – 3. as well. Merely the porphyrin catalysed NO release doesn’t yield this intermediate. The common mechanism for NO release derived for compounds with hydroxyiminopartial structure with the intermediate hydroxylamine as NO donor was shown in former investigations. This could be demonstrated only for some oximes in this study, which is noteworthy with regard to the haemotoxicity of these compounds. The toxic effect can be caused by the hydrolysis to give hydroxylamine. By comparing the results of the chemiluminescence measurement from Angelis salt, hydroxylamine and FLOX (to be indicative of the oximes) it was shown that the oxidation to yield nitrite need not only have come from nitric oxide but also from nitroxyl. This seems to be dependend on the electronic state of NO-. The reaction of singlet nitroxyl with iodosylbenzene gives nitrite rather than NO whereas triplet nitroxyl is more likely to yield nitric oxide under the same conditions. Copper sulphate reacts with both types to give NO. In addition, the NO release from derivates of the protein-tyrosine phosphatase inhibitor dephostatin, which, so far, has not been known as nitric oxide donor, was investigated. The amount increased in the presence of the model system, which indicates a potential influence of cytochrome-P450. In the presence of the model system NO generation from an O-alkylated oxime as negative control was detected. This result can be the basis of further researches into the NO release from these compounds.