Novel diagnostic methods for central nervous system tumors using liquid biopsies

Abstract

Um einen Tumor des zentralen Nervensystems (ZNS) zu diagnostizieren, wird für histopathologische und molekulare Analysen eine Gewebsbiopsie benötigt. Diese ist nicht immer verfügbar, da nicht immer eine sichere Entnahme gewährleistet werden kann, mit besonderen Schwierigkeiten bei pädiatrischen Patient:innen. Es besteht ein großer Bedarf an minimal-invasiven Methoden, die eine genaue molekulare Analyse des Tumors, und somit eine exakte Diagnose, erlauben. Dafür wurde in dieser Arbeit Liquor, insbesondere zell-freie DNA als Analyt, untersucht. In einem ersten Ansatz wurde die droplet digital PCR (ddPCR) etabliert. Sie stellte sich als informative Methode für Punktmutationen und Kopienzahlveränderungen von Genen heraus. Die Methode ist sehr sensitiv und in keiner der 29 analysierten Patient:innenproben wurde ein falsch-positives Signal beobachtet. Methylierungsarrays und Next-Generation-Sequenzierungsansätze sind theoretisch in der Lage, bei einer initialen Diagnose zu helfen, ohne dass vorher etwas über den Tumor bekannt ist. Die Ergebnisse der hier getesteten Methoden waren allerdings nicht überzeugend. Nanopore-Sequenzierung erlaubt die zeitgleiche Aufnahme von DNA-Sequenz und Methylierung. In dieser Arbeit wurde das Protokoll für kurze, stark fragmentierte DNA angepasst. Kopienzahlprofile, die mithilfe der Sequenz berechnet wurden, wurde ausgewertet, um Verluste und Zugewinne nachzuweisen; die Methylierung wurde mit Hilfe eines Random Forest Klassifikationsverfahrens analysiert. 197 Liquorproben wurden analysiert und in 48.6% aller technisch einwandfreien Proben konnte zell-freie DNA, die vom Tumor stammte, nachgewiesen werden. Die Methode erlaubt es, eine initiale Diagnose ohne vorherige Informationen oder Verdachtsdiagnosen zu erstellen. Es wurde eine neue, minimal-invasive diagnostische Methode für ZNS-Tumoren etabliert, die das Potential hat, in die klinische Routinediagnostik implementiert zu werden.

Diagnosing a central nervous system (CNS) tumor relies heavily on histopathological and molecular analysis of tumor tissue. This is not always feasible as tumor tissue cannot always be obtained safely, with especially difficult situations in pediatric patients. There is a great need for minimally invasive CNS tumor diagnostics that can molecularly diagnose the tumor, and its development was the aim of this work. For this, cerebrospinal fluid (CSF) was investigated, specifically cell-free DNA (cfDNA) as an analyte isolated from it. As a first attempt, droplet digital PCR (ddPCR) was established. It proves to be an informative approach, for specific single nucleotide variants as well as copy number variations of defined genes. It is very sensitive and in none of the 29 analyzed patient samples, a false positive was observed. Methylation arrays and next-generation sequencing approaches would in theory allow an uninformed approach to make an initial diagnosis. Yet, both methods were not ideal for the analysis of cfDNA and did not deliver satisfactory results that would allow an implementation of this method into routine diagnostics. Nanopore sequencing permits the analysis of sequence as well as methylation simultaneously. The protocol was adapted for the use with short, fragmented DNA. Copy number variation plots calculated from the sequence were used to capture gains and losses, and the methylation was used to classify the tumor exactly using a random forest classifier. 197 samples were analyzed and in 48.6% of all technically successful samples, tumor-derived cfDNA could be found. This approach grants the possibility to diagnose a tumor without prior knowledge of the tissue, and the use in long-term monitoring settings. A novel, minimally-invasive diagnostic method for CNS tumors has thus been developed that has potential to be adapted into clinical routine.