A culture model for the assessment of phenylalanine neurotoxicity in phenylketonuria

Abstract

Die Erkrankung Phenylketonurie (PKU) ist eine angeborene Stoffwechselerkrankung, ausgelöst durch Mutationen des Phenylalanin-Hydroxylase (PAH)-Gens. Durch die Mutation kommt es bei der PKU zu einer Akkumulation von Phenylalanin (Phe), einem Mangel an Tyrosin (Tyr) sowie einer reduzierten Synthese von Katecholamin-Neurotransmittern. Das klinische Bild der PKU ist geprägt durch eine schwere geistige Retardierung sowie das Auftreten von epileptischen Anfällen bereits im frühen Kindesalter. Trotz großer Forschungsbestrebungen und zahlreichen experimentellen PKU-Studien, bleibt der exakte Einfluss hoher Phe-/niedriger Tyr-Spiegel auf den Phänotyp der PKU unbekannt. Unter Verwendung organotypischer hippokampaler Schnittkulturen und einem optimierten Kulturmedium untersuchten wir den direkten Einfluss hoher Phe-/niedriger Tyr-Spiegel auf die synaptische und gliale Integrität bei der PKU. Der Hippokampus eignet sich zur Beantwortung dieser Fragestellung hervorragend, da diese Hirnregion keine intrinsische Katecholamin- Neurotransmitter-Synthese besitzt. Dies bietet die Möglichkeit den Effekt hoher Phe-/niedriger Tyr-Spiegel losgelöst von potenziellen neurotoxischen Effekten einer dysregulierten Katecholamin-Neurotransmitter-Synthese zu betrachten. Wir verglichen Kulturen, die hohen Phe-/Tyr-Spiegeln und Kulturen, die physiologischen Phe-/Tyr-Spiegeln ausgesetzt waren. Mithilfe von Capillary Western Blots und immunhistochemischen Untersuchungen analysierten wir die Expression verschiedener synaptischer Proteine (PSD95, Synaptopodin, SNAP25, Synaptophysin), Gliazellmarker (GFAP , Iba1, P2Y12, CD68, C3b) und die Gliazell- Morphologie. Wir konnten eine transiente Herunterregulation des postsynaptischen Proteins PSD95 sowie des präsynaptischen Proteins SNAP-25 nach drei Wochen Kultur zeigen. Spannenderweise normalisierte sich im weiteren Verlauf der Kultur dieses Expressionsmuster, sodass bereits nach 6 Wochen Kultur kein Effekt mehr vorhanden war. Das Expressionsmuster glialer Proteine zeigte sich während der gesamten Zeit völlig unauffällig. Unsere Ergebnisse zeigen, dass hohe Phe-/niedrige Tyr-Spiegel keinen direkten Einfluss auf die synaptische und gliale Funktion ausüben und damit wahrscheinlich nicht die Ursache der geistigen Retardierung bei der PKU sind, sondern vielmehr eine dysregulierte Katecholamin- Neurotransmitter-Synthese zum Phänotyp der PKU führt.