Establishment of cell lines expressing erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1) variants of choice to study Plasmodium falciparum cytoadherence associated functions

Abstract

Malaria, caused by a unicellular eukaryotic apicomplexan parasite of the genus Plasmodium, remains a leading cause of morbidity and mortality globally. The pathological most relevant species for humans is Plasmodium falciparum which is responsible for almost all of the malaria related deaths. The symptoms of the disease are exclusively caused by the asexual stages of the parasite’s life cycle, during which the parasites multiply in erythrocytes of the host. Erythrocytes infected with P. falciparum can cytoadhere to various host receptors and ligands on the endothelium to evade the removal of the infected erythrocytes in the spleen. This can lead to blockage and inflammation of blood vessels, cutting off tissue from oxygen support, and resulting in severe forms of the disease, such as cerebral malaria. The interaction of infected erythrocytes with the host´s endothelium is mediated by a large parasite encoded transmembrane protein presented on the erythrocyte surface termed Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1). PfEMP1 variants possess differing binding properties and are expressed by a multigene family, the var genes. The expression of var genes in the parasite is mutually exclusive so that a parasite expresses only a single var gene. Furthermore, the parasites can switch their var gene expression over time, enabling the parasites to persistently evade the host´s immune system, facilitating long lasting infections. PfEMP1 is considered a key factor for the parasite’s virulence and survival, rendering it as the main virulence factor of P. falciparum parasites. However, the study of specific PfEMP1 variants and var genes has been hampered by PfEMP1s large size and the fact that parasite in vitro cultures are a mix of parasites expressing different PfEMP1s, making them inaccessible to genetic manipulation and molecular analysis. In this thesis, selection linked integration (SLI) was exploited to generate cell lines that express a single HA-tagged PfEMP1 of choice in the entire population of parasites in an in vitro culture. The predominant expression of targeted var genes were validated for transgenic 3D7 and IT4 (formerly FCR3) lab strains by bulk RNA sequencing. The trackability of the HA-tagged PfEMP1s in the cell was demonstrated with immunofluorescence assays. Trypsin cleavage assays confirmed the surface presentation of the targeted PfEMP1 variant in most cases. SLI modified 3D7 and IT4 parasites expressing VAR2CSA or a CD36-binding PfEMP1 variant on the erythrocyte surface were tested and compared for binding against corresponding ligands. This provided empirical evidence that the IT4 strain is superior for the study of PfEMP1-mediated binding while 3D7 parasites only showed poor binding. To increase binding assay throughput and comparability, a semi-automated pipeline was developed for standardized evaluation of binding assays. Furthermore, PfEMP1 variants were activated in IT4 parasites that showed specific binding against the major endothelial cell receptors CD36, ICAM-1 and EPCR, validating the feasibility of this approach. These cell lines are expected to facilitate the study of the binding properties of different PFEMP1 variants without the need to subject the parasites to elaborate receptor or antibody selection procedures. This will enable the comparison of binding capacities and to explore potentially novel interacting receptors of specific PfEMP1 variants. The trackability of the HA-tagged PfEMP1 was further exploited to study PfEMP1 transport into the host cell in 3D7 parasites. In order to do this, an approach to conditionally block protein transport through PTEX, the translocon pumping exported proteins into the host cell, was chosen. When PTEX was blocked, PfEMP1 was no longer exported. The timing of this approach in the parasite blood cycle was chosen in a way to minimize the effect of accessory factors needed for PfEMP1 transport which would indirectly lead to a failure of PfEMP1 export. Overall, these experiments indicated that PfEMP1 is transported by PTEX into the host cell. Next, BioID experiments were conducted to determine the proxiome of PfEMP1 in living parasites. For this the biotin ligase BirA* was fused to three distinct positions of PfEMP1, resulting in three different cell lines. Testing of the cell lines expressing the PfEMP1-BirA* fusions showed that the modified PfEMP1s were predominantly expressed in the parasite cultures and functionally presented on the host cells surface, exhibiting binding against the expected receptors. Large scale BioID experiments with subsequent mass spectrometry analysis of biotinylated proteins identified proteins shown to be important for PfEMP1s transport and function as well as previously characterized and uncharacterized proteins of the Maurer´s clefts, erythrocyte membrane and other host cell structures. The proxiome of the three positions showed marginal differences to each other, indicating that PfEMP1 is not transported as an integral membrane protein. Furthermore, only partial overlap with a Maurer’s clefts proxiome indicated the detected hits were PfEMP1-specific. Notably six exported proteins with unknown function previously not linked to cytoadherence were identified and termed PfEMP1-interacting candidate 1-6 (EMPIC1-6). Subsequently, a modified version of SLI, SLI2, was utilized to introduce a second endogenous modification to the cell lines harboring a SLI-activated var gene. This was used to disrupt candidate proteins identified in the proxiome to evaluate their role in PfEMP1-mediated cytoadherence. The evaluation of PfEMP1 presentation and function with trypsin cleavage assays and binding assays led to the discovery of two novel proteins that are needed for the efficient cytoadherence of P. falciparum parasites despite the fact that their disruption did not ablate PfEMP1 surface transport. In summary, this thesis -by utilizing SLI techniques - successfully generated and validated cell lines expressing specific PfEMP1 variants, which is expected to substantially aid studies on the interaction between these proteins and host cell receptors, var gene switching mechanisms and transport of PfEMP1. This work not only advances our understanding of P. falciparum´s main virulence factor but also opens new avenues to illuminate the cellular mechanisms that enable cytoadherence, leading to a better understanding of the parasite-host interactions.

Malaria wird durch einen einzelligen eukaryotischen Apicomplexa-Parasiten der Gattung Plasmodium verursacht und bleibt weltweit eine führende Ursache für Morbidität und Mortalität. Die für den Menschen pathologisch relevanteste Spezies ist Plasmodium falciparum, welche für fast alle Malaria-bedingten Todesfälle verantwortlich ist. Die Symptome der Krankheit werden ausschließlich durch die asexuellen Stadien des Lebenszyklus des Parasiten verursacht. Während dieser vermehrt sich der Parasiten in den Erythrozyten des Wirts. Erythrozyten, die mit P. falciparum infizierte sind, können an verschiedene Rezeptoren und Liganden des Wirts auf den Endothelzellen zytoadhärieren, wodurch diese der Zerstörung durch die Milz entgehen. Dies kann zu Entzündungen bis hin zum Verschluss der Blutgefäße führen, wodurch Gewebe von der Sauerstoffversorgung abgeschnitten wird. Dies führt zu schweren Formen wie zum Beispiel Malaria, einer der schwersten Komplikationen dieser Infektion. Die Interaktion infizierter Erythrozyten mit den Endothelzellen des Wirts wird durch ein großes auf der Oberfläche der Erythrozyten präsentiertes Parasite-Transmembranprotein hervorgerufen, bekannt als P. falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1). Verschiedene PfEMP1-Varianten besitzen unterschiedliche Bindungseigenschaften und werden von einer Multigenfamilie, den var-Genen, kodiert. Die Expression von var-Genen im Parasiten ist sich gegenseitig ausschließend, das heißt, dass ein Parasit jeweils nur ein einzelnes var-Gen exprimiert. Außerdem verändern die Parasiten ihre var-Gene expression über die Zeit. Dies ermöglicht es den Parasiten, dauerhaft dem Immunsystem des Wirts zu entgehen und langanhaltende Infektionen zu manifestieren. PfEMP1 wird deshalb als Schlüsselfaktoren für die Virulenz und das Überleben des Parasiten angesehen, weshalb dieser als Hauptvirulenzfaktor von P. falciparum-Parasiten bezeichnet werden. Die Untersuchung spezifischer PfEMP1-Varianten und var-Gene wird durch die große Größe von PfEMP1 sowie durch die Tatsache erschwert, dass Parasiten in In-vitro-Kulturen eine Mischung von var-Genen exprimieren. Dies macht sie für genetische Manipulationen und molekulare Analysen schwer zugänglich. In dieser Dissertation wurde das Selection Linked Integration (SLI)-System genutzt, um Zelllinien zu generieren, die in der gesamten Parasitenpopulation einer in-vitro-Kultur ein einzelnes erwünschtes HA-markiertes PfEMP1 exprimieren. Die Expression der Ziel-var-Gene wurde für transgene SLI-Parasitenpopulationen durch Bulk-RNA-Sequenzierung validiert. Die HA-markierten PfEMP1s konnte in der Zelle mit Immunfluoreszenzexperimenten lokalisiert werden und der Oberflächenproteinverdau mit Trypsin bestätigte für die meisten Zelllinien die Oberflächenpräsentation der modifizierten PfEMP1-Variante. Es wurden zwei P. Falciparum Laborstämme mit SLI-modifiziert, 3D7 und IT4 (ehemals FCR3), die VAR2CSA oder eine CD36-bindende PfEMP1-Variante auf der Oberfläche der Erythrozyten exprimierten, wurden auf ihre Bindungseigenschaften verglichen, indem ihre Bindung gegenüber entsprechenden Liganden getestet wurden. Dies lieferte empirische Hinweis dafür, dass der IT4-Parasitenstamm für die Untersuchung von PfEMP1-Bindungen geeigneter ist als der 3D7-Parasitentamm, welcher lediglich schwache Bindung zeigte. Um den Durchsatz und die Vergleichbarkeit von Bindungsexperimenten zu verbessern, wurde eine semi-automatisierte Pipeline für eine standardisierte Auswertung von Bindungsexperimenten entwickelt. Darüber hinaus wurden in IT4-Parasiten PfEMP1-Varianten aktiviert, welche eine spezifische Bindung gegen die prominentesten interagierenden Zellrezeptoren, CD36, ICAM-1 und EPCR zeigten. Dies validierte die Zuverlässigkeit des SLI-Systems für diese Anwendungen. Es ist zu erwarten, dass diese Zelllinien die Erforschung der Bindungseigenschaften verschiedener PfEMP1-Varianten vereinfachen, da diese Parasiten ohne Rezeptor- oder Antikörperselektion generiert wurden. Dies ermöglicht den Vergleich der Bindungskapazitäten und die Erforschung potenzieller neuer interagierender Rezeptoren spezifischer PfEMP1-Varianten. Des Weiteren wurde die Möglichkeit das HA-markierten PfEMP1 in der Zelle zu lokalisieren genutzt, um den Transport von PfEMP1 in die Wirtszelle bei 3D7-Parasiten zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde der Proteinexport durch das PTEX-Translocon, welches exportierte Proteine in die Wirtszelle transloziert, induzierbar blockiert. Bei einer Blockierung von PTEX, wurde PfEMP1 nicht mehr in die Wirtszelle exportiert. Der Zeitpunkt der Blockierung wurde im asexuellen Zyklus so induziert, dass früh exportierte Proteine, die potenziell für den PfEMP1-Transport benötigt werden, nicht beeinflusst wurden, da diese indirekt den Export von PfEMP1 beeinflussen könnten. Insgesamt deuten die Ergebnisse dieser Experimente darauf hin, dass PfEMP1 durch PTEX in die Wirtszelle transloziert wird. Außerdem wurden BioID-Experimente durchgeführt, um Proteine in der Umgebung (Proxiom) von PfEMP1 in lebenden Parasiten zu identifizieren. Dafür wurde die Biotin-Ligase BirA* an drei unterschiedliche Positionen von PfEMP1 fusioniert, wodurch drei verschiedenen Zelllinien hergestellt wurden. Für diese Zelllinien wurde gezeigt, dass die PfEMP1-Varianten mit dem fusionierten BirA* prädominant in der Parasitenkulturen exprimiert und auf der Oberfläche der Wirtszellen präsentiert wurden. Des Weiteren wurden die Bindung der modifizierten PfEMP1 gegen die erwarteten Rezeptoren zeigten. BioID-Experimente im großen Maßstab mit anschließender Massenspektrometrie-Analyse der biotinylierten Proteine identifizierten Proteine, die für den Transport und die Funktion von PfEMP1 relevant sind. Darüber hinaus wurden zuvor charakterisierte und nicht charakterisierte Proteine der Maurer´schen Spalten, der Erythrozytenmembran und anderer Strukturen der Wirtszelle detektiert. Das Proxiom der drei Positionen zeigte nur kleine Unterschiede zueinander, was darauf hinweist, dass PfEMP1 nicht als integrales Membranprotein transportiert wird. Darüber hinaus deutete eine nur teilweise Überlappung mit einem Proxiom der Maurer´schen Spalten darauf hin, dass die detektierten Proteine PfEMP1-spezifisch waren. Dadurch wurden sechs exportierte Proteine mit unbekannter Funktion, die zuvor nicht mit Zytoadhärenz in Verbindung gebracht wurden, identifiziert und als PfEMP1-Interacting Candidate 1-6 (EMPIC1-6) benannt. Des Weiteren wurde eine modifizierte Version von SLI, SLI2, angewandt, um eine zweite endogene Modifikation in den Zelllinien einzubringen, die bereits ein SLI-aktiviertes var-Gene beherbergten. Dies wurde verwendet, um die Funktion von Kandidatenproteine, die im Proxiom identifiziert wurden, zu trunkieren und deren Rolle im Transport und Oberflächenpräsentation von PfEMP1 zu ermitteln. Dies führte zur Identifizierung von zwei neuen Proteinen, die in Oberfächenproteinverdau- und Bindungsexperimenten zeigten, dass diese Kandidaten relevant für die effiziente Zytoadhärenz von P. falciparum-Parasiten sind. Jedoch wurde der Transport von PfEMP1 an die Oberfläche durch die Disruption der Kandidatenproteine nicht beeinflusst. Zusammenfassend hat diese Dissertation - durch die Nutzung von SLI-Techniken - erfolgreich Zelllinien generiert und validiert, die spezifische PfEMP1-Varianten exprimieren Es ist zu erwarten, dass dies die Studien über die Interaktion dieser Proteine mit Wirtszellrezeptoren, var-Gen-Expressionsmechanismen und den Transport von PfEMP1 erheblich vereinfachen wird. Diese Arbeit erweitert nicht nur unser Verständnis des Hauptvirulenzfaktors von P. falciparum, sondern eröffnet auch neue Wege, um die zellulären Mechanismen der Zytoadhärenz zu beleuchten, was dabei helfen wird, die Parasiten-Wirt-Interaktion besser zu verstehen.