CTC-enrichment of larger sample volumes utilizing a slanted spiral microfluidic device and subsequent culture in microwells

Abstract

Krebserkrankungen sind ursächlich für ein Viertel aller Todesfälle in Deutschland. Die meisten Patient:innen versterben nicht an dem Primärtumor, sondern an den Folgen von Tumormetastasen. Diese werden durch zirkulierende Tumorzellen (CTCs) initiiert, welche sich vom Ursprungstumor lösen, in die Blutgefäße einwandern und in peripheren Geweben zu der Bildung von Zweittumoren führen. CTCs können im Patient:innenblut mit einer sogenannten Liquid Biopsy detektiert werden und für anschließende Analysen genutzt werden. Ex vivo Kulturen in Kombination mit Empfindlichkeitstestungen auf Arzneimittel könnten den nächsten Fortschritt in der personalisierten Krebstherapie bedeuten. In den meisten Blutproben befindet sich allerdings nur eine geringe Anzahl an CTCs. Diese Einschränkung kann durch eine Steigerung des untersuchten Blutvolumens überwunden werden. In dieser Arbeit soll geprüft werden, ob die Slanted Spiral Methode sich zur Prozessierung größerer Proben und anschließender in-vitro Kultivierung von CTCs in Microwells eignet. Zuerst erfolgte die Etablierung eines Protokolls zur optimalen Anwendung der Methode. Die höchste Aufreinigung der Proben mit einer durchschnittlichen PBMC-Eliminierungsrate von 97% konnte bei einer Zellkonzentration von 6x106 Zellen pro ml und einer Flussgeschwindigkeit von 1.7 ml pro Minute erzielt werden. Die durchschnittliche Rückgewinnungsrate von MCF-7 Zellen lag bei 71%, wobei unsere Ergebnisse darauf hinwiesen, dass apoptotische Zellen häufiger eliminiert wurden als intakte Zellen. Anschließend wurden Blutproben von 12 metastasierten Brustkrebspatientinnen mit der Slanted Spiral Methode auf CTCs untersucht und Detektionsraten mit der CellSearch® Methode verglichen. Patientinnenproben mit einem Volumen von bis zu 51 ml wurden prozessiert. Verglichen mit CellSearch® Ergebnissen konnte eine Übereinstimmung in CTC-Anzahl gezeigt werden (Cohen’s kappa=0.75). Die mit der Slanted Spiral Methode angereicherte und in Microwells kultivierten MCF-7 Zellen vermehrten sich in 36 Tagen um den Faktor 1000. Außerdem konnte zelluläres Wachstum in zwei Kulturen von Ovarialkarzinompatientinnen beobachtet werden, welche sich unter dem Fluoreszenzmikroskop positiv für Keratine und DAPI zeigten, allerdings noch nicht sicher durch NGS als Krebszellen identifiziert werden konnten. Aus den Proben der Brustkrebspatientinnen konnte keine erfolgreiche Kultur angezüchtet werden.