Vergleichende Validation von real-time PCR-Assays für den Nachweis von Cystoisospora belli als Testvergleich ohne Goldstandard

Abstract

Cystoisospora (C.) belli ist ein den Kokzidien zugehöriger Parasit, der bei immungeschwächten Patienten mit akuter oder chronischer Gastroenteritis assoziiert ist. Die Empfindlichkeit der Mikroskopie als diagnostisches Standardverfahren wird als unzureichend beschrieben. In der hier vorgestellten Studie wurden zwei Echtzeit-PCRs, die auf ribosomale RNA-Gensequenzen (Tabelle 3) von C. belli im Stuhl abzielen, in einem Testvergleich ohne Referenzstandard unter Verwendung der Latent-Class-Analyse (LCA) vergleichend untersucht. Dazu wurden insgesamt 1000 Stuhlproben, zum großen Teil von ghanaischen HIV-Patienten (n = 905) sowie soldatischen Einsatzrückkehrern aus den Tropen (n = 95) mit beiden Tests parallel untersucht. Nach dem Ausschluss von 33 Proben, die eine PCR-Hemmung (Sequenz Kombiplasmid siehe Tabelle A1) zeigten, wurden 29 bzw. 33 positive Ergebnisse mit der 5,8S-rRNA-Gen/ITS-2-Sequenz-spezifischen PCR bzw. der ITS-2-Sequenz-spezifischen PCR registriert, was zu einer genauigkeitsbereinigten Prävalenz im untersuchten Kollektiv von 3,2% führte. Eine nahezu perfekte Übereinstimmung zwischen beiden Assays wurde durch Fleiss' Kappa von 0,933 bei einer Sensitivität und Spezifität von 92,8% und 100% sowie 100% und 99,8% für die 5,8S-rRNA-Gen/ITS-2-Sequenz-PCR bzw. die ITS-2-Sequenz PCR belegt (Tabelle 1). Beide Tests erwiesen sich als geeignet für den Diagnose von C. belli in menschlichen Stuhlproben mit einer etwas besseren Empfindlichkeit des ITS-2-Sequenz-Assays, während die 5,8S-rRNA-Gen/ITS-2-Sequenz-PCR zur Bestätigungstestung aufgrund ihrer geringfügig höheren Spezifität in Betracht gezogen werden kann.

Cystoisospora (C.) belli is a coccidian parasite associated with acute or chronic gastroenteritis in immunocompromised patients. Dissatisfactory sensitivity of microscopy as the diagnostic standard approach has been described. Here, two real-time PCRs targeting ribosomal RNA gene sequences (table 3) of C. belli in stool in a test comparison were comparatively evaluated without a reference standard applying latent class analysis. Therefore, 1000 stool samples mostly obtained from Ghanaian HIV (human immunodeficiency virus) patients (n = 905) as well as from military returnees from the tropics (n = 95) were assessed by both assays in parallel. After the exclusion of 33 samples showing PCR inhibition (positive control plasmid insert, table A1), 29 and 33 positive results were recorded with the 5.8S rRNA gene/ITS-2 sequence PCR and the ITS-2 sequence PCR, respectively, resulting in an accuracy-adjusted prevalence of 3.2%. Nearly perfect agreement between both assays was indicated by Fleiss' kappa of 0.933 with sensitivity and specificity of 92.8% and 100% as well as 100% and 99.8% for the 5.8S rRNA gene/ITS-2 sequence PCR and the ITS-2 sequence PCR, respectively (table 1). Both assays proved to be suitable for the diagnosis of C. belli in human stool samples with slightly better sensitivity of the ITS-2 sequence assay, while the 5.8S rRNA gene/ITS-2 sequence PCR may be considered for confirmatory testing.