Expression of Arc/Arg3.1 in GABAergic neurons and in hippocampal-septal circuits, regulates Learning, memory and stress-related disorders

Abstract

Excessive stress and neurodegenerative diseases are conditions in which aversive memories may become excessively strong or imprecise, resulting in a generalized feeling of fear that is no longer linked to the original environment or context of the aversive event. In extreme cases, this can lead to psychiatric disorders like post-traumatic stress disorder (PTSD) and major depression. Understanding how aversive memories are encoded and stored is thus essential for preventing and treating neuropsychological disorders. In this study, I undertook to investigate the circuits and network mechanisms underlying fear memory consolidation, stress, and depression-like behaviors. I focused on GABAergic neurons and circuits capable of expressing the activity-regulated gene Arc/Arg3.1, known for its vital role in memory consolidation. I traced Arc/Arg3.1 expression to identify brain regions and neuronal subtypes participating in fear memory consolidation and stress-evoked behaviors. I also utilized genetic deletion of the gene and optogenetic suppression to manipulate specific elements in the fear memory circuit. I performed multi-electrode in vivo recordings to investigate the consequences of Arc/Arg3.1 deletion on network activity in the circuit. I also employed a range of behavioral tests to assess memory, anxiety, and depression-like behaviors. In the first part of this thesis, I investigated the role of the hippocampal-lateral septum circuitry in fear memory processing. I identified simultaneous upregulation of Arc/Arg3.1 in the hippocampus and the lateral septum, a GABAergic nucleus, and traced a monosynaptic projection pathway from dorsal CA1 to dorsal LS (dCA1-dLS). I injected a retrograde AAV virus encoding an inhibitory channelrhodopsin (stGtACR) bilaterally into the LS and implanted optical fibers above the dorsal dCA1, where dense expression of stGtACR was observed. The mice underwent fear conditioning and were tested in the stimulus context and a novel context 7 (recent memory) and 21 (remote memory) days later. Our results demonstrate that optical suppression of the dCA1-dLS circuit during memory acquisition or retrieval did not diminish freezing in the original context but abnormally enhanced freezing in a novel context, suggesting that this specific circuit is intimately involved in preventing memory generalization and enhancing memory specificity. To better understand the role of Arc/Arg3.1 in the dHPC-dLS circuit, an AAV-Cre virus was bilaterally injected into dHPC or dLS in Arc/Arg3.1f/f mice. Following region-specific ablation of Arc/Arg3.1 (HPC-cKO or LS-cKO), mice were subjected to fear conditioning and memory tests. As previously shown, HPC-cKO mice showed increased freezing in the novel context in the remote memory test (Xiaoyan Gao, 2016). Interestingly, the LS-cKO mice showed excessive freezing in the novel context in the recent memory test. Together, these findings demonstrate that concurrent upregulation of Arc/Arg3.1 in the HPC and dLS modulate the precision of remote and recent contextual memory. To investigate the impact of Arc/Arg3.1 on network activity in the dCA1-dLS circuitry, I conducted in vivo, two-site local field potential (LFP)- and unit-recordings from Arc/Arg3.1 germline KO, HPC-cKO, and LS-cKO mice. I analyzed the firing rates of individual neural subtypes and performed power spectral analysis of the regional-LFPs and their coherence as a measure of their inter-areal communication. The studies revealed alterations in oscillatory activity associated with memory consolidation processes. Specifically, reduced theta (3-5.2 Hz) and gamma (20-90 Hz) power was observed in the dCA1 of Arc/Arg3.1 germline KO mice but not of HPC-cKO and LS-cKO mice, confirming previous findings of early-life effects of Arc/Arg3.1 on hippocampal activity and indicating that an acute ablation of Arc/Arg3.1 in the adult brain no longer affects the hippocampal LFP. In contrast, the power of gamma and high-frequency (120-180 Hz) oscillations (HFO) in the dLS was markedly diminished in germline KO, HPC-cKO, and LS-cKO mice, demonstrating that constitutive Arc/Arg3.1 expression in the HPC-LS circuitry is required to maintain network activity in the dLS. Analysis of the power coherence, phase locking value, and Granger causality revealed abnormal communication from dCA1→dLS upon deletion of Arc/Arg3.1 in the LS, highlighting its importance in maintaining an appropriate information flow between the regions. Acute ablation of Arc/Arg3.1 in the hippocampus (HPC-cKO mice) reduced the firing rates of excitatory and inhibitory units in dCA1 and dLS, whereas acute dLS ablation (LS-cKO mice) increased them. My findings demonstrate a profound regulation of neuronal and network activity in the dCA1-dLS circuitry by Arc/Arg3.1 that likely underlies its impact on memory generalization. In the second part of the thesis, I investigated the impact of Arc/Arg3.1 expression in GABAergic neurons on stress-related behavior. The inducibility of Arc/Arg3.1 by stress was investigated by exposing WT mice to physical constraints. Dramatic upregulation of Arc/Arg3.1 was observed in the LS but not in the hippocampus, suggesting a preferential induction in GABAergic neurons of this brain area. Using RNAscope technology, I localized Arc/Arg3.1 transcripts to parvalbumin-positive neurons exclusively in the thalamic reticular nucleus (TRN) and somatostatin-positive neurons in the lateral septum, TRN, and claustrum and less frequently in the hippocampus and cortex. Conditional KO of Arc/Arg3.1 in parvalbumin (PV) and somatostatin (SST) neurons were generated by breeding Arc/Arg3.1f/f mice with either PV-Cre or SST-Cre mice, respectively. In both cases, a comprehensive and cell-specific deletion of Arc/Arg3.1 was achieved. The mice underwent stress-related behavior tests, including the open field, elevated plus maze, forced swimming, and tail suspension. The PV-cKO mice showed normal behaviors in all tests. In contrast, the SST-cKO mice showed less center area exploration time in the open field test and more immobility in the forced swimming test. In the third part, I investigated contextual and spatial memory in PV-cKO and SST-cKO mice. PV-cKO mice performed normally in the Morris water maze (MWM) learning and memory tests and during the flagged-platform re-learning test. In contrast, the SST-cKO showed normal learning in the MWM test's hidden-platform version but slower learning in the subsequent flagged-platform task, possibly indicating re-learning inflexibility. In addition, SST-cKO mice displayed impaired context discrimination in fear memory tests, similar to the deficit seen in part I following the acute deletion of Arc/Arg3.1 in the dLS. These findings suggest that Arc/Arg3.1 expression in PV neurons does not contribute to the stress-related behaviors or memory processes tested here. In comparison, Arc/Arg3.1 in the SST-positive neurons may contribute to depression-like or other stress-related disorders in mice and modulate precise fear memory consolidation. In summary, my study breaks new ground by identifying a hippocampal-lateral septum circuit essential for modulating fear learning, memory consolidation, and memory precision. Moreover, my findings reveal how the expression of Arc/Arg3.1 in this circuit shapes local and inter-areal activity patterns required for memory consolidation. My findings in SST-cKO mice confirmed that the processing of fear memory and its precision relies on the expression of Arc/Arg3.1 in this GABAergic population of the LS. This study shed new light on the link between memory, stress, and depressive-like behavior.

Übermäßiger Stress und neurodegenerative Erkrankungen sind Faktoren, bei denen aversive Erinnerungen übermäßig stark oder ungenau werden können, was zu einem allgemeinen Gefühl der Angst führt, das nicht mehr mit der ursprünglichen Umgebung oder dem Kontext des aversiven Ereignisses verbunden ist. In extremen Fällen kann dies zu psychiatrischen Störungen wie der posttraumatischen Belastungsstörung (PTBS) und schweren Depressionen führen. Zu verstehen, wie aversive Erinnerungen kodiert und gespeichert werden, ist daher für die Vorbeugung und Behandlung neuropsychologischer Störungen von entscheidender Bedeutung. In dieser Studie untersuchte ich die Schaltkreise und Netzwerkmechanismen, die der Konsolidierung von Furchtgedächtnis, Stress und depressionsähnlichen Verhaltensweisen zugrunde liegen. Ich konzentrierte mich auf GABAerge Neuronen und Schaltkreise, die in der Lage sind, das aktivitätsregulierte Gen Arc/Arg3.1 zu exprimieren, das für seine wichtige Rolle bei der Gedächtniskonsolidierung bekannt ist. Ich untersuchte die Expression von Arc/Arg3.1, um Hirnregionen und neuronale Subtypen zu identifizieren, die an der Konsolidierung des Furchtgedächtnisses und an durch Stress ausgelösten Verhaltensweisen beteiligt sind. Außerdem nutzte ich die genetische Deletion des Gens und die optogenetische Suppression, um bestimmte Komponenten des Angstgedächtnis-Schaltkreises zu manipulieren. Ich führte in-vivo-Ableitungen mit mehreren Elektroden durch, um die die Konsequenzen der Arc/Arg3.1-Deletion auf die Netzwerkaktivität zu bestimmen. Außerdem setzte ich eine Reihe von Verhaltenstests ein, um Gedächtnis, Angst und depressionsähnliche Verhaltensweisen zu untersuchen. Im ersten Teil dieser Arbeit untersuchte ich die Rolle des Schaltkreises zwischen Hippocampus und lateralem Septum bei der Verarbeitung von Angstgedächtnis. Ich stellte eine gleichzeitige Hochregulierung von Arc/Arg3.1 im Hippocampus und im lateralen Septum, einem GABA-ergen Kern, fest und identifizierte eine monosynaptische Projektionsbahn vom dorsalen CA1 zum dorsalen LS (dCA1-dLS). Ich injizierte ein retrogrades AAV-Virus, das für ein inhibitorisches Channelrhodopsin (stGtACR) kodiert, bilateral in den LS und implantierte optische Fasern über dem dorsalen dCA1, wo eine dichte Expression von stGtACR beobachtet wurde. Die Mäuse wurden einer Furchtkonditionierung unterzogen und 7 (recent memory) und 21 (remote memory) Tage später im Konditionierungskontext und in einem neuen Kontext getestet. Meine Ergebnisse zeigen, dass die optische Suppression des dCA1-dLS-Schaltkreises während des Gedächtniserwerbs oder -abrufs das Erstarren im ursprünglichen Kontext nicht verringerte, aber das Erstarren in einem neuen Kontext abnormal verstärkte, was darauf hindeutet, dass dieser spezifische Schaltkreis eng mit der Verhinderung der Gedächtnisgeneralisierung und der Verstärkung der Gedächtnisspezifität verbunden ist. Um die Rolle von Arc/Arg3.1 im dHPC-dLS-Schaltkreis besser zu verstehen, wurde ein AAV-Cre-Virus bilateral in dHPC oder dLS von Arc/Arg3.1f/f-Mäusen injiziert. Nach der regionsspezifischen Ablation von Arc/Arg3.1 (HPC-cKO oder LS-cKO) wurden die Mäuse einer Furchtkonditionierung- und Gedächtnistests unterzogen. Wie bereits gezeigt, zeigten HPC-cKO-Mäuse erhöhtes Erstarren im neuen Kontext beim Gedächtnistest am Tag 21 (remote memory) (Xiaoyan Gao, 2016). Interessanterweise zeigten die LS-cKO-Mäuse erhöhtes Erstarren im neuen Kontext beim Gedächtnistest am Tag 7 (recent memory). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die gleichzeitige Hochregulierung von Arc/Arg3.1 im HPC und dLS die Präzision des Kontextgedächtnisses (sowohl recent als auch remote memory) moduliert. Um die Auswirkungen von Arc/Arg3.1 auf die Netzwerkaktivität im dCA1-dLS-Schaltkreis zu untersuchen, habe ich in vivo lokale Feldpotentiale (LFP) und Unit-Recordings von Arc/Arg3.1 Keimbahn-KO-, HPC-cKO- und LS-cKO-Mäusen in zwei Gehirnarealen durchgeführt. Ich analysierte die Feuerungsraten der einzelnen neuronalen Subtypen und führte eine Power Spectral-Analyse der regionalen LFPs und ihrer Kohärenz als Maß für ihre interareale Kommunikation durch. Die Analysen ergaben Veränderungen in der oszillatorischen Aktivität, die mit Gedächtniskonsolidierungsprozessen verbunden sind. Insbesondere wurde eine verringerte Theta- (3-5,2 Hz) und Gamma-Power (20-90 Hz) im dCA1 von Arc/Arg3.1 Keimbahn-KO-Mäusen, nicht aber von HPC-cKO- und LS-cKO-Mäusen beobachtet. Dies bestätigt vorhergehende Befunde über die Auswirkungen von Arc/Arg3.1 auf die Aktivität des Hippocampus im frühen Lebensalter und deutet darauf hin, dass eine akute Ablation von Arc/Arg3.1 im erwachsenen Gehirn die Hippocampus-LFP nicht mehr beeinflusst. Im Gegensatz dazu war die Power von Gamma- und hochfrequenten (120-180 Hz) -Oszillationen (HFO) im dLS bei Keimbahn-KO-, HPC-cKO- und LS-cKO-Mäusen deutlich vermindert. Dies zeigt, dass die konstitutive Arc/Arg3.1-Expression im HPC-LS-Schaltkreis zur Aufrechterhaltung der Netzwerkaktivität im dLS erforderlich ist. Die Analyse der Power-Kohärenz, des Phase-Locking-Wertes und der Granger-Kausalität zeigte eine abnormale Kommunikation von dCA1→dLS nach Deletion von Arc/Arg3.1 im LS. Dies unterstreicht die Bedeutung der Arc/Arg3.1-Expression für die Aufrechterhaltung eines angemessenen Informationsflusses zwischen den Regionen. Die akute Ablation von Arc/Arg3.1 im Hippocampus (HPC-cKO-Mäuse) reduzierte die Feuerungsraten von erregenden und hemmenden Einheiten in dCA1 und dLS, während die akute dLS-Ablation (LS-cKO-Mäuse) diese erhöhte. Meine Ergebnisse zeigen eine tiefgreifende Regulierung der neuronalen und Netzwerkaktivität im dCA1-dLS-Schaltkreis durch Arc/Arg3.1, die wahrscheinlich dem Einfluss von Arc/Arg3.1 auf die Gedächtnisgeneralisierung zugrunde liegt. Im zweiten Teil der Arbeit untersuchte ich die Auswirkungen der Arc/Arg3.1-Expression in GABAergen Neuronen auf stressbedingtes Verhalten. Die Induzierbarkeit von Arc/Arg3.1 durch Stress wurde untersucht, indem WT-Mäuse einer körperlichen Belastung ausgesetzt wurden. Eine drastische Hochregulierung von Arc/Arg3.1 wurde im LS, aber nicht im Hippocampus beobachtet, was auf eine bevorzugte Induktion in den GABAergen Neuronen dieses Hirnbereichs hindeutet. Mit Hilfe der RNAscope-Technologie lokalisierte ich Arc/Arg3.1-Transkripte in Parvalbumin-positiven Neuronen ausschließlich im thalamischen retikulären Nukleus (TRN) und in Somatostatin-positiven Neuronen im lateralen Septum, TRN und Claustrum und weniger häufig im Hippocampus und Kortex. Konditionale KO von Arc/Arg3.1 in Parvalbumin- (PV) und Somatostatin- (SST) Neuronen wurden durch Verpaarung von Arc/Arg3.1f/f-Mäusen mit PV-Cre- bzw. SST-Cre-Mäusen erzeugt. In beiden Fällen wurde eine umfassende und zellspezifische Deletion von Arc/Arg3.1 erreicht. Die Mäuse wurden stressbedingten Verhaltenstests unterzogen, darunter der offene Feldtest, das erhöhte Plus-Labyrinth, erzwungenes Schwimmen und Schwanzaufhängung. Die PV-cKO-Mäuse zeigten in allen Tests normale Verhaltensweisen. Im Gegensatz dazu verbrachten die SST-cKO-Mäuse weniger Zeit bei der Erkundung des zentralen Bereichs im offenen Feldtest und zeigten größere Immobilität im forcierten Schwimmtest. Im dritten Teil untersuchte ich das kontextuelle und räumliche Gedächtnis bei PV-cKO- und SST-cKO-Mäusen. PV-cKO-Mäuse zeigten normale Leistungen in den MWM-Lern- und Gedächtnistests und im Test zum Wiedererlernen einer sichtbaren, markierten Plattform. Die SST-cKO-Mäuse dagegen zeigten zwar ein normales Lernen in der versteckten Version des Morris-Wasserlabyrinth-Tests, allerdings lernten sie langsamer in einer anschließenden Aufgabe eine sichtbare, markierte Plattform zu finden. Dies weist möglicherweise auf eine Inflexibilität beim Wiedererlernen hin. Darüber hinaus zeigten SST-cKO-Mäuse eine beeinträchtigte Kontextunterscheidung in Furchtgedächtnistests, ähnlich dem Defizit, das in Teil I nach akuter Deletion von Arc/Arg3.1 in der dLS beobachtet wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Expression von Arc/Arg3.1 in PV-Neuronen nicht zu den hier getesteten stressbedingten Verhaltensweisen oder Gedächtnisprozessen beiträgt. Im Vergleich dazu könnte Arc/Arg3.1 in den SST-positiven Neuronen zu depressionsähnlichen oder anderen stressbedingten Störungen bei Mäusen beitragen und die Konsolidierung des präzisen Furchtgedächtnisses modulieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Studie Neuland betritt, indem sie einen Schaltkreis zwischen Hippocampus und lateralem Septum identifiziert, der für die Modulation von Furchtlernen, Gedächtniskonsolidierung und die Präzision des Gedächtnisses wesentlich ist. Außerdem zeigen meine Ergebnisse, wie die Expression von Arc/Arg3.1 in diesem Schaltkreis lokale und interareale Aktivitätsmuster formt, die für die Gedächtniskonsolidierung erforderlich sind. Meine Ergebnisse in SST-cKO-Mäusen bestätigten, dass die Verarbeitung von Furchtgedächtnis und die Präzision des Gedächtnisses von der Expression von Arc/Arg3.1 in dieser GABAergen Population des LS abhängt. Meine Studie wirft ein neues Licht auf den Zusammenhang zwischen Gedächtnis, Stress und depressionsähnlichem Verhalten.