Structural studies on the ribosomal exit tunnel as a regulator of translation and target of antimicrobials

Abstract

Die Proteinsynthese ist ein wesentlicher Prozess in allen lebenden Systemen, der hauptsächlich während der Translation durch das Ribosom stattfindet. Während der Translation polymerisieren die Ribosomen eine naszierende Polypeptidkette, die sich in den Ausgangstunnel erstreckt. Dieser Tunnel ist eine strukturelle Schlüsselkomponente des Ribosoms und ein entscheidender Akteur im Prozess, der die Proteinfaltung, das Targeting und die Regulierung der Genexpression in verschiedenen Szenarien beeinflusst. Die kumulativen Forschungsarbeiten haben bedeutende strukturelle Einblicke in die Rolle des bakteriellen ribosomalen Ausgangstunnels bei der Translationsregulation und sein Potenzial als Ziel für antimikrobielle Peptide geliefert. In dieser Arbeit wird die Kryo-EM umfassend genutzt, um detaillierte Mechanismen der durch spezifische Arrestpeptide ausgelösten Translationsblockade aufzudecken, was zu unserem Verständnis der bakteriellen Genexpressionsregulation und der Wirkung von Antibiotika beiträgt. Es wurde festgestellt, dass RAPP-haltige Arrest-Peptide die Translation abwürgen, indem sie in die Aktivität der ribosomalen Peptidyltransferase eingreifen. Die Studie untersucht speziell ApdA, das effizient grampositive bakterielle Ribosomen abwürgt, und ApdP, das sowohl grampositive als auch gramnegative bakterielle Ribosomen abwürgt, obwohl es bei gramnegativen Arten konserviert ist. Hochauflösende Kryo-EM-Strukturen von Ribosomen aus Bacillus subtilis und Escherichia coli, die durch ApdA bzw. ApdP blockiert werden, zeigen, dass diese Peptide die Bildung der nachfolgenden Peptidbindung verhindern, indem sie ein einzelnes Wasserstoffatom an der Pro-tRNA in der A-Seite stabilisieren. Dieser Mechanismus verdeutlicht die Rolle des RAPP-Motivs als wesentliches "Arrestmodul" und des N-terminalen Abschnitts als "Regulatormodul" und liefert ein detailliertes mechanistisches Verständnis dafür, wie diese Peptide die ribosomale Translation aufhalten. Dieser Mechanismus ist analog zu dem durch das SecM-Peptid induzierten Abwürgen. Das SecM-Arrest-Peptid reguliert die Genexpression in E. coli durch Abwürgen der Translation. Die Studie korrigiert frühere Modelle, indem sie mittels Cryo-EM zeigt, dass SecM das Ribosom abwürgt, indem es die Pro-tRNA in der A-Stelle stabilisiert und die Bildung einer Peptidbindung mit der Peptidyl-tRNA in der P-Stelle verhindert. Diese Forschung zeigt eine Verdichtung der naszierenden SecM-Kette zu einer α-Helix innerhalb des ribosomalen Tunnels, im Gegensatz zu früheren Erkenntnissen. Molekulardynamiksimulationen deuten darauf hin, dass die von SecA auf die naszierende Kette ausgeübten Zugkräfte den Translationsstillstand aufheben können, indem sie eine lokale Entfaltung bewirken, wodurch die Translation fortgesetzt werden kann. Diese Forschungsarbeit bietet neue Einblicke in die strukturelle Grundlage des SecM-induzierten Translationsstopps und unterstreicht die konservierte Strategie der Translationsregulation bei verschiedenen Bakterienarten. Der ribosomale Ausgangstunnel ist auch das Ziel für die Bindung vieler antimikrobieller Verbindungen. Das glykosylierte prolinreiche antimikrobielle Peptid (PrAMP) Drosocin wird von Drosophila-Arten zur Bekämpfung bakterieller Infektionen produziert. Im Gegensatz zu vielen PrAMPs ist Drosocin an Threonin 11 O-glykosyliert, was seine antimikrobielle Aktivität verstärkt. Die Kryo-EM-Analyse von Drosocin-SRC zeigt, dass sich das glykosylierte Drosocin im Polypeptid-Ausgangstunnel des Ribosoms bindet und den Freisetzungsfaktor RF1 abfängt, wodurch eine ordnungsgemäße Beendigung der Proteinsynthese verhindert wird. Die Glykosylierung an Thr11 interagiert mit U2609 der 23S rRNA und verursacht Konformationsänderungen, die die Basenpaarung mit A752 stören, wodurch der gebundene RF1 stabilisiert und die Translation gehemmt wird. Diese Studie unterstreicht das Potenzial für die Entwicklung neuer antimikrobieller Wirkstoffe auf der Grundlage der strukturellen Merkmale von glykosyliertem Drosocin und bietet eine Grundlage für die Entwicklung synthetischer Derivate mit verbesserten antimikrobiellen Eigenschaften und geringer Toxizität. Insgesamt liefert diese Arbeit umfassende strukturelle und mechanistische Erkenntnisse darüber, wie spezifische Arrestpeptide und antimikrobielle Wirkstoffe mit dem bakteriellen Ribosom interagieren, um die Translation zu regulieren. Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung des ribosomalen Exit-Tunnels als kritische Stelle für die Translationskontrolle und als vielversprechendes Ziel für neuartige Antibiotika und tragen damit zu einem breiteren Verständnis der bakteriellen Genexpression und der Mechanismen der Antibiotikaresistenz bei.

Protein synthesis is an essential process in all living systems, primarily occurring during translation by the ribosome. During translation, ribosomes polymerize a nascent polypeptide chain that extends into the exit tunnel. This tunnel is a key structural component of the ribosome and a crucial player in the process, influencing protein folding, targeting, and the regulation of gene expression across various scenarios. The cumulative research undertaken has provided significant structural insights into the role of the bacterial ribosomal exit tunnel in translation regulation and its potential as a target for antimicrobial peptides. This work extensively utilizes cryo-EM to reveal detailed mechanisms of translational stalling induced by specific arrest peptides, further contributing to our understanding of bacterial gene expression regulation and antibiotic action. RAPP-containing arrest peptides have been identified to induce translational stalling by interfering with the ribosomal peptidyltransferase activity. The study specifically examines ApdA, which efficiently stalls Gram-positive bacterial ribosomes, and ApdP, which stalls both Gram-positive and Gram-negative bacterial ribosomes despite being conserved among Gram-negative species. High-resolution cryo-EM structures of ribosomes from Bacillus subtilis and Escherichia coli stalled by ApdA and ApdP, respectively, reveal that these peptides prevent the formation of the subsequent peptide bond by stabilizing a single hydrogen atom on the Pro-tRNA in the A-site. This mechanism elucidates the role of the RAPP motif as an essential "arrest module" and the N-terminal stretch as a "regulator module," providing a detailed mechanistic understanding of how these peptides halt ribosomal translation. This mechanism is found to be analogous to the stalling induced by the SecM peptide. SecM arrest peptide regulates gene expression in E. coli by stalling translation. The study corrects previous models by demonstrating through cryo-EM that SecM stalls the ribosome by stabilizing the Pro-tRNA in the A-site, preventing peptide bond formation with the peptidyl-tRNA in the P-site. This research reveals a compaction of the nascent SecM chain into an α-helix within the ribosomal tunnel, contrary to previous structural findings. Molecular dynamics simulations suggest that pulling forces exerted by SecA on the nascent chain can relieve the translational arrest by causing local unfolding, thereby allowing translation to proceed. This research provides new insights into the structural basis of SecM-induced translational stalling and highlights the conserved strategy of translational regulation among diverse bacterial species. The ribosomal exit tunnel also constitutes the target for the binding of many antimicrobial compounds. The glycosylated proline-rich antimicrobial peptide (PrAMP) drosocin is produced by Drosophila species to combat bacterial infections. Unlike many PrAMPs, drosocin is O-glycosylated at threonine 11, which enhances its antimicrobial activity. Cryo-EM analysis of drosocin-SRC reveals that glycosylated drosocin binds within the polypeptide exit tunnel of the ribosome and traps release factor RF1, preventing proper termination of protein synthesis. The glycosylation at Thr11 interacts with U2609 of the 23S rRNA, causing conformational changes that disrupt its base-pairing with A752, thus stabilizing the bound RF1 and inhibiting translation. This study highlights the potential for developing new antimicrobial agents based on the structural features of glycosylated drosocin and provides a basis for designing synthetic derivatives with enhanced antimicrobial properties and low toxicity. Overall, this body of work provides comprehensive structural and mechanistic insights into how specific arrest peptides and antimicrobial agents interact with the bacterial ribosome to regulate translation. The findings underscore the importance of the ribosomal exit tunnel as a critical site for translational control and a promising target for novel antibiotics, thereby contributing to the broader understanding of bacterial gene expression and antibiotic resistance mechanisms.