Untersuchung der Genexpression im Verlauf der terminalen Differenzierung von Osteoblasten

Abstract

5 Zusammenfassung

Der adulte Knochen ist zusammengesetzt aus Knochen-resorbierenden Osteoklasten, Knochen-bildenden Osteoblasten und Osteozyten, d.h. terminal differenzierten Osteoblasten mit unbekannter physiologischer Funktion. Wie bedeutend das Gleichgewicht dieser zellulären Aktivitäten ist, zeigt die gesundheitspolitische Bedeutung der Osteoporose, einer Erkrankung, die im Alter zu Knochenmasseverlust und erhöhter Frakturneigung führt. Da Osteoporose bislang nur unzureichend behandelt werden kann, ist es wichtig, neue therapeutische Ansatzpunkte zu finden, was zum Beispiel durch die Identifizierung von Genen erreicht werden kann, die bei der Regulation der Knochenformation eine Rolle spielen. Vor diesem Hintergrund sollte in der vorliegenden Dissertation die terminale Differenzierung von Osteoblasten molekulargenetisch untersucht werden. Der erste Schritt hierzu war die Kultivierung und Differenzierung primärer Osteoblasten, die aus Schädeldächern neugeborener Mäuse gewonnen wurden. An Tag 5 und Tag 25 der durch Ascorbat und ß-Glycerophosphat eingeleiteten Differenzierung wurde anschließend mRNA isoliert, die in Zusammenarbeit mit Dr. Streichert in der Abteilung für Klinische Chemie für eine Affymetrix Gen-Chip-Hybridisierung eingesetzt wurde. Durch diese Methode konnte simultan das Expressionsprofil von über 30000 Genen quantitativ erfasst werden, um somit Gene zu identifizieren, die in mineralisierten (Tag 25) im Gegensatz zu nicht-mineralisierten (Tag 5) Kulturen in ihrer Expresssion induziert wurden. Im nächsten Schritt sollte für einige dieser Gene das Gewebe-spezifische Expressionsmuster mittels RT-PCR analysiert werden. Die Kombination beider Methoden führte zur Etablierung einiger Kandidatengene (z.B. Dkk1, Ptprz oder OF45), deren Expression einerseits in der terminalen Osteoblasten-Differenzierung stark induziert wird und andererseits relativ spezifisch für Knochengewebe ist. Die funktionelle Analyse einiger dieser Gene ist Ziel weiterführender Experimente. Zudem sollte es allerdings auch möglich sein, durch Generierung einer transgenen Mauslinie mit Osteozyten-spezifischer Expression der Cre-Rekombinase Gene in vivo selektiv in Osteozyten zu deletieren. Um dieses Ziel langfristig zu erreichen, wurde im letzten Teil der vorliegenden Dissertation ein genomisches Fragment des OF45-Gens isoliert, das nun zur genetischen Manipulation (d.h. Integration der Cre-Rekombinase) zur Verfügung steht.