Liquid Biopsy-Methylierungsanalysen der Tumorsuppressorgene CADM1 und MAL am Beispiel des Zervixkarzinoms

Abstract

In Deutschland ist das Zervixkarzinom die fünfthäufigste bösartige Tumorentität der Frau. Hauptrisikofaktor ist hierbei eine Infektion mit humanen Papillomaviren (HPV) vom high-risk Typ. Bei einer großen HPV-Impflücke und Teilnahmeraten von circa 47% am Vorsorgeprogramm gibt es in Deutschland Potenzial zur Verbesserung der Versorgung. Dieses Potenzial könnte zum Teil durch niedrigschwellige präventive diagnostische Angebote, die beispielsweise über eine venöse Blutentnahme umgesetzt werden könnten, ausgeschöpft werden. Ein Weg hin zu solch einem Angebot stellt das Methodenfeld der Liquid Biopsy dar, bei der zum Beispiel über die Analyse von zellfreier, im Blut zirkulierender DNA (cfDNA) Informationen über Tumoren gesammelt werden können. Ein anderes vielversprechendes Einsatzgebiet der Liquid Biopsy neben der Früherkennung stellt das Tumormonitoring von in diesem Fall Zervixkarzinompatientinnen dar. Methylierungsanalysen von Zervixkarzinomgewebe haben gezeigt, dass Methylierungen des cell adhesion molecule 1 (CADM1) und des myelin and lymphocyte protein (MAL) in über 90% aller hochgradigen intraepithelialen Zervixneoplasien (CIN) und invasiven Zervixkarzinomen vorhanden sind. In dieser Arbeit wurde ein Liquid Biopsy Assay zum Nachweis von MAL- und CADM1-Methylierungen an cfDNA von Zervixkarzinompatientinnen entwickelt. Die Detektion der Methylierungen erfolgte mittels quantitativer methylierungsspezifischer Polymerase-Kettenreaktion (qMSP). Eine Evaluation der an Liquid Biopsy Bedingungen angepassten qMSP erfolgte mittels Abstrichproben von CIN-Patientinnen und einem Vergleich bereits vorhandener Daten aus der Literatur. Von 52 Zervixabstrich-Proben von CIN 2- und CIN 3-Patientinnen zeigte sich in 86,5% der Fälle eine CADM1 und/oder MAL- (CADM1/MAL) Methylierung. In cfDNA-Proben von 24 Zervixkarzinompatientinnen wurde in 83,3 % der Fälle eine CADM1/MAL-Methylierung nachgewiesen. Bei reinen Plattenepithelkarzinomen waren es 86,4%; bei bestätigt HPV-positiven 94,1%. In Kombination mit einer Spezifität von 95,5% gegenüber gesunden Probandinnen und einer area under the curve (AUC) von 0,872 in der receiver operating characteristic (ROC)-Analyse konnte geschlussfolgert werden, dass die technische Umsetzung der CADM1/MAL-qMSP in Liquid Biopsy erfolgreich war und in Bezug zur Klinik schlüssige Daten liefert. So bildet der Nachweis von CADM1/MALMethylierungen in cfDNA einen Grundstein für weitergehende Liquid Biopsy Analysen am Zervixkarzinom und dessen Vorläuferläsionen.

In Germany, cervical cancer is the fifth most common malignant tumor entity in women. The main risk factor is infection with high-risk human papillomaviruses (HPV). With a large HPV vaccination gap and screening participation rates of approximately 47%, there is potential to improve coverage in Germany. This potential could be partially xploited by low-threshold preventive diagnostic services that could be implemented, for example, via venous blood sampling. One route to such an offer is the method field of liquid biopsy, in which, for example, information about tumors can be collected via the analysis of cell-free DNA circulating in the blood (cfDNA). Another promising area of application for liquid biopsy, in addition to early detection, is tumor monitoring of patients with cervical cancer. Methylation analyses of cervical cancer tissue have shown that methylations of cell adhesion molecule 1 (CADM1) and myelin and lymphocyte protein (MAL) are present in more than 90% of all high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and invasive cervical cancer. In this work, a liquid biopsy assay was developed to detect MAL and CADM1 methylations on cfDNA from cervical cancer patients. Methylations were detected by quantitative methylation-specific polymerase chain reaction (qMSP). The qMSP, which was adapted to liquid biopsy conditions, was evaluated using smear samples from CIN patients and a comparison of existing data from the literature. Of 52 cervical smear samples from CIN 2 and CIN 3 patients, 86.5% showed CADM1 and/or MAL (CADM1/MAL) methylation. In cfDNA samples from 24 cervical carcinoma patients, CADM1/MAL methylation was detected in 83.3% of cases. In pure squamous cell carcinomas, it was 86.4%; in confirmed HPV-positive 94.1%. In combination with a specificity of 95.5% compared to healthy donors and an area under the curve (AUC) of 0.872 in the receiver operating characteristic (ROC) analysis, it could be concluded that the technical implementation of CADM1/MAL-qMSP in liquid biopsy was successful and provides conclusive data in relation to the clinic. Thus, detection of CADM1/MAL methylation in cfDNA represents a cornerstone for more extensive liquid biopsy analyses of cervical cancer and its precursor lesions.