Automatizität in Engineered Heart Tissue

Abstract

In dieser Arbeit wurde dem Ursprung der Automatizität von Kardiomyozyten, welche von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC-CM) abgeleitet und als artifizielles Herzgewebe (EHT) kultiviert wurden, nachgegangen. Das spontane Schlagen der EHTs stellt einen zentralen Unterschied zu ventrikulärem Myokard dar und könnte die Einsatzgebiete der EHTs erheblich limitieren. In der Literatur wurden erniedrigte Konzentrationen des sarkoplasmatischen Calsequestrin in hiPSC-CM nachgewiesen, welches als Kalziumpufferprotein die Kalziumfreisetzung und damit einen zentralen Mechanismus der spontanen Erregung im adulten Myokard hemmt. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe ergaben deutlich erniedrigte mRNA Werte für Calsequestrin in hiPSC-CM im Vergleich zu ventrikulärem Myokard. Daher untersuchten wir den Effekt einer Calsequestrin-Überexpression in hiPSC-CM auf ihre spontane Schlagfrequenz. Eine Adenovirus-assoziierte Virus (AAV)-vermittelte Calsequestrin-Überexpression war auf Proteinebene erfolgreich. Allerdings konnte in den funktionellen Versuchen der EHTs kein negativ chronotroper Effekt nachgewiesen werden. Eher zeigte sich eine höhere Frequenz im Vergleich zu den Kontrollen. Auch ein alternatives AAV-Konstrukt, welches potentielle Fehlerquellen vermeiden sollte, lieferte ähnliche Ergebnisse – keine reduzierte Spontanfrequenz nach Calsequestrin- Überexpression. Die unveränderte Form der Aktionspotentiale erhärtete den Verdacht, dass die Calsequestrin-Überexpression keinen wesentlichen Effekt auf die elektrophysiologischen Eigenschaften der EHTs hatte. Um der Genese der Automatizität weiter auf den Grund zu gehen wurde der Einfluss diverser Pharmaka auf die spontane Schlagfrequenz untersucht. Hemmung des Natrium-Kalzium-Austauschers mittels SEA0400 reduzierte die Aktionspotentialdauer, das spontane Schlagverhalten der EHTs blieb jedoch unverändert. Eine Erhöhung der Kaliumleitfähigkeit durch den Stimulator ATP-abhängiger Kaliumkanäle Cromakalim konnte die spontane Frequenz signifikant reduzieren, sodass die Spontanaktivität fast aller EHTs sistierte. Dabei blieb das maximale diastolische Potential unverändert. Eine Stimulation von muskarinergen Rezeptoren durch Carbachol zeigte einen signifikanten negativ chronotropen Effekt, welcher aber ebenfalls nicht über eine weitere Negativierung des maximal diastolischen Potentials vermittelt wurde. Da die Aktionspotentialdauer nicht verkürzt wurde, ist der Effekt nicht über den Acetylcholin-abhängigen Kaliumkanal vermittelt. Ivabradin hatte einen starken dosisabhängigen Effekt mit Reduktion der Spontanfrequenz. Dabei konnte die Spontanaktivität nahezu vollständig unterdrückt werden. Zusammenfassend lässt dich die Automatizität im Wesentlichen auf den If zurückführen. Durch Ivabradin fällt der depolarisierende If weg. Durch Cromakalim wird der depolarisierende If kompensiert. Carbachol sorgt für weniger If, ohne dabei auf die Acetylcholin-abhängige Kaliumleitfähigkeit Einfluss zu nehmen. Die beobachteten Aktionspotentialcharakteristika lassen sich am ehesten Zellen niederer Schrittmacherzentren des Herzens wie den Purkinje Fasern zuordnen.