Characterization of SusD-homologs from the phylum Bacteroidota and their ability to bind distinct polymers

Abstract

The phylum Bacteroidota comprises ubiquitous microorganisms with a distinguished way to acquire glucan. The “starch utilization system” (sus) operon presents genes that encode three glycoside hydrolases (GH; SusA, SusB and SusG), one transmembrane protein (SusC), three binding modules (SusD, SusE and SusF) and the transcriptional regulator SusR. SusD is an essential binding module that facilitates the bacterial acquisition of nutrients. Although SusD-like proteins were previously evaluated with distinct natural polymers, they were never characterized with synthetic polymers before. Synthetic polymers, especially fossil-fuel based pollutants, are a major concern because they accumulate in the environment and enter the food chain in the form of micro- or nanoplastics. The objective of this work was to characterize three susD-homologs from elephant feces (susD70111 and susD38489) (Ilmberger et al., 2014) or cow rumen (susD1) (Rosewarne et al., 2014) metagenomes regarding their adsorption to plastics. Each protein presented an N-terminal signal peptide Sec/SPII, which was removed. Using pull-down assays, fluorescence measurements and surface plasmon resonance (SPR), SusD1Δ1-22 and SusD38489Δ1-25 were identified as cellulose binding modules, while SusD70111Δ1-20 preferentially bound chitin. The pull-down assays were also performed with polyethylene terephthalate (PET), polyamide 6 (nylon 6; PA6) and low-density polyethylene (LDPE), with preliminary adsorption detected for each protein. SPR analysis was performed for bis(2-Hydroxyethyl) terephthalate (BHET; a PET degradation product), in which the proteins are strongly bound. In every assay performed, SusD1Δ1-22 presented the best performance. Therefore, it was fused to two previously characterized enzymes with catalytic activity towards PET. However, an optimization of enzymatic activity was not observed. The proteins labelled with the fluorescence tag superfolder GFP (sfGFP) were also used for the construction of plastic reporter assays. Due to the high background of sfGFP with plastics, the data was not conclusive. The chitin binding module SusD70111 was fragmented and the truncated version named SusD70111F3 showed putative adsorption to PET and BHET. Structural and phylogenetic analysis of the binding modules revealed that SusD1 and SusD38489 share sequence and structure similarity, but SusD70111 is evolutionary distant and clusters with SusD-like proteins from a distinct niche (hot springs). Docking studies also pointed to the putative amino acids involved in protein-substrate adsorption. Here, SusD was characterized with synthetic polymers for the first time. This work will aid in the construction of further translational protein fusions and improvements on the reporter analysis of micro- and nanoplastics.

Das Phylum der Bacteroidota umfasst eine ubiquitär vorkommende Gruppe Mikroorganismen, die sich durch eine hohe Diversität and Glucanasen und Gylcosylhydrolasen auszeichnen. Das Operon des „Stärkeverwertungssystems“ (sus) umfasst Gene, die für drei Glykosidhydrolasen (GH; SusA, SusB und SusG), ein Transmembranprotein (SusC), drei Bindungsmodule (SusD, SusE und SusF) und den Transkriptionsregulator SusR kodieren. SusD ist ein Stärke-Binde Protein and der Zelloberfläche. Obwohl SusD-ähnliche Proteine bereits mit verschiedenen natürlichen Polymeren untersucht wurden, wurden sie noch nie mit Hinblick uaf ihre Bindung mit synthetischen Polymeren charakterisiert. Synthetische Polymere, insbesondere auf fossilen Brennstoffen basierende Kunsstoffe (Plastik), stellen ein großes Problem dar, da sie sich in der Umwelt anreichern und in Form von Mikro- oder Nanoplastik in die Nahrungskette gelangen. Ziel dieser Arbeit war es, drei susD-Homologe aus Elefantenkot (susD70111 und susD38489) (Ilmberger et al., 2014) oder aus Rinderpansen (susD1) (Rosewarne et al., 2014) Metagenomen hinsichtlich ihrer Adsorption an Kunststoffe zu charakterisieren. Jedes Protein wies ein N-terminales Signalpeptid Sec/SPII auf, das entfernt wurde. Mithilfe von Pull-down-Assays, Fluoreszenzmessungen und Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden SusD1Δ1-22 und SusD38489Δ1-25 als Cellulose-Bindungsmodule identifiziert, während SusD70111Δ1-20 bevorzugt Chitin band. Die Pull-down-Tests wurden auch mit Polyethylenterephthalat (PET), Polyamid 6 (Nylon 6; PA6) und Polyethylen niedriger Dichte (LDPE) durchgeführt, wobei für jedes Protein eine erste Adsorption festgestellt wurde. Die SPR-Analyse wurde für Bis(2-Hydroxyethyl)terephthalat (BHET; ein PET-Abbauprodukt) durchgeführt, an das die Proteine stark gebunden sind. In jedem durchgeführten Test zeigte SusD1Δ1-22 die beste Bindung. Daher wurde es mit zwei zuvor charakterisierten Enzymen mit katalytischer Aktivität gegenüber PET fusioniert. Eine Optimierung der enzymatischen Aktivität wurde jedoch nicht beobachtet. Die mit dem Fluoreszenz-Tag superfolder GFP (sfGFP) markierten Proteine wurden auch für die Konstruktion von Kunststoff-Reporter-Assays verwendet. Aufgrund des hohen Hintergrunds von sfGFP mit Kunststoffen waren die Daten nicht schlüssig. Das Chitinbindungsmodul SusD70111 wurde fragmentiert und die verkürzte Version mit der Bezeichnung SusD70111F3 zeigte eine putative Adsorption an PET und BHET. Eine strukturelle und phylogenetische Analyse der Bindungsmodule ergab, dass SusD1 und SusD38489 Sequenz- und Strukturähnlichkeiten aufweisen, SusD70111 jedoch evolutionär weit entfernt ist und sich mit SusD-ähnlichen Proteinen aus einer anderen Nische (heiße Quellen) gruppiert. Docking-Studien wiesen auch auf die mutmaßlichen Aminosäuren hin, die an der Protein-Substrat-Adsorption beteiligt sein könnten. In der vorliegenden Dissertation wurde SusD zum ersten Mal mit Hinblick auf die Bindung von synthetischen Polymeren charakterisiert. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse werden zukünftig bei der Konstruktion weiterer Reporterfusionen und Bindeproteinen für Mikro- und Nanokunststoffen eine wichtige Grundlage bieten.