Identifizierung und Charakterisierung von multiresistenten klinischen Isolaten von E. coli ST131 mittels Rapid-Parallel Multilocus Sequence Typing

Abstract

Eine wichtige Ursache für die weltweit zu beobachtende Zunahme von multipler Antibiotikaresistenz ist die Ausbreitung einiger sich besonders stark verbreitender Erreger. Ein solcher multiresistenter pandemischer Erreger ist E. coli ST131, der Harnwegsinfekte (HWI), Bakteriämien und Sepsis verursacht und aufgrund seiner Resistenzen, insbesondere gegen Fluorchinolone (FQ) und β-Lactam-Antibiotika sowie seiner klinischen Relevanz und Verbreitung von besonderem Interesse ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand zum einen darin, die Prävalenz von E. coli ST131 innerhalb klinischer Kollektive unterschiedlichen Zeitraums und lokalen Ursprungs mittels Multilocus Sequence Typing (MLST) zu bestimmen. Zum anderen stand die Analyse der zugrundeliegenden molekularen Ursachen der Resistenzeigenschaften und deren Verbreitungswege im Fokus. Das erste E. coli Kollektiv entstammte dem resistance surveillance project der British Society of Antimicrobial Chemotherapie von repräsentativ gesammelten klinischen Isolaten aus Bakteriämien in England von 2001 bis 2004. Die Arbeit zeigt, dass sich darin bereits E. coli ST131 Isolate unter den Stämmen mit einer erhöhten MHK für Ciprofloxacin (≥ 0,25-256 µg/mL) befanden, wobei ihr Anteil über die Jahre kontinuierlich anstieg. War 2001 noch kein ST131 Isolat im Kollektiv vertreten, waren es 2004 bereits 43,8 %. Die Daten weisen auf den Beginn der Ausbreitung von E. coli ST131 in England mit Start im Jahre 2002 hin. Das zweite Kollektiv stammte aus einer Studie der Paul-Ehrlich-Gesellschaft von 2016 in Deutschland und beinhaltete Isolate aus HWI und Bakteriämien. In diesem waren 31,6 % der Isolate gegen mindestens ein Antibiotikum resistent und 8,2 % der Isolate multiresistent (3MRGN). Der Anteil an E. coli ST131 Isolaten lag insgesamt bei 10,7 %. Unter den gegen Ciprofloxacin resistenten sowie auch unter den 3MRGN Isolaten lag er jeweils bei 50 %. Hinsichtlich der genetischen Grundlage für die FQ-Resistenz wurde in den E. coli ST131 Isolaten zumeist eine Doppelmutation in den bakteriellen Topoisomerase-Genen gyrA und parC detektiert. In Bezug auf die β-Lactam-Resistenz wurden in den gegen Ampicillin resistenten Isolaten β-Lactamasen vom TEM- oder SHV-Typ identifiziert und in den gegen Cefotaxim resistenten solche vom CTX-M-Typ, meist CTX-M-15. Eine neue Next-Generation Sequencing (NGS) Anwendung, genannt Rapid-Parallel Multilocus Sequence Typing (RP-MLST), wurde etabliert und ermöglichte die parallele Sequenzierung der relevanten MLST-, Housekeeping-, Resistenz-, Target- und resistenzassoziierten Gene von mehreren Stämmen gleichzeitig. Durch die Sequenzierung wurden in den E. coli ST131 Isolaten zwei noch nicht beschriebene Mutationen gefunden, die einen FQ-Resistenz vermittelnden Effekt haben könnten: erstens die Mutation acrR fM1, die wahrscheinlich zur Folge hat, dass acrR nicht translatiert wird und in der konstitutiven Expression der von acrAB codierten multidrug-resistance (MDR)-Effluxpumpe AcrAB-TolC resultieren könnte; zweitens die Mutation ompR A35D, die potentiell eine zusätzliche Phosphorylierungsstelle in OmpR erzeugt und so über eine Aktivierung zu OmpR-P die Regulation der Porine OmpC und OmpF beeinflussen könnte. Außerdem wurden zwei neue Allele des Housekeeping-Gens pabB in E. coli identifiziert. Multiresistente E. coli ST131 Isolate wurden auf das Vorhandensein von Plasmiden untersucht. In allen Fällen wurde mindestens ein Plasmid nachgewiesen, in manchen Fällen sogar bis zu fünf, einige mit Größen von 60 bis zu > 100 kbp. Für ein klinisches E. coli ST131 Isolat konnte gezeigt werden, dass Gene für Resistenz gegen Ampicillin, Gentamicin und Cefotaxim auf einen empfindlichen Stamm übertragen wurden. Dabei wurde der Erwerb von Plasmiden und Resistenzgenen, sowie die Übertragung von Mehrfachresistenz nachgewiesen. Die Ergebnisse liefern Erkenntnisse zu dem global präsenten Pathogen E. coli ST131 und seinen pandemischen Subklonen ST131 H30-R und ST131 H30-Rx, deren Resistenzmechanismen, R-Faktoren und Verbreitung der Multiresistenz. Darüber hinaus liefern sie Erkenntnisse zur zeitlichen Verbreitung und Entwicklung innerhalb der ST131 Linie.

The development of multiple antibiotic resistance worldwide is mainly driven by few intensively spreading pathogens. One of these pandemic high-risk clones is E. coli ST131, which causes urinary tract infections (UTI), bloodstream infections (BSI) and sepsis, and due to its multidrug-resistances (MDR), especially to fluoroquinolones (FQ) and β-lactam antibiotics, as well as its clinical relevance and spread, is of particular interest. This study aimed to investigate the prevalence of E. coli ST131 within clinical strain collections from different time periods and local origins, using multilocus sequence typing (MLST). Furthermore, this work focussed on the analysis of the underlying molecular mechanisms of antibiotic resistance and gene transfer. The first E. coli strain collection consisted of clinical isolates from bacteraemia obtained in the UK between 2001 and 2004 as part of the resistance surveillance project of the British Society of Antimicrobial Chemotherapy. This work shows, that E. coli ST131 isolates were already present in strains with increased MICs of ciprofloxacin (≥ 0.25-256 µg/mL), and their amount increased continuously over the years. While no ST131 isolate was present in 2001, an increase to 43.8 % in 2004 was detected. The data indicate that the spread of E. coli ST131 in England started in 2002. The second strain collection from a study of the Paul-Ehrlich-Society conducted in Germany 2016, contained UTI und BSI isolates. It showed 31.6 % of strains with resistance against at least one antibiotic and 8.2 % with multidrug resistance (3MRGN). Therefore, E. coli ST131 isolates accounted for 10,7 % of all isolates, whilst 50 % of the ciprofloxacin resistant, as well as the 3MRGN isolates, respectively. Regarding the genetic background causing FQ-resistance in E. coli ST131 isolates, in most strains a double mutation in bacterial topoisomerase coding genes gyrA and parC was detected. In relation to β-lactam resistance, in all strains showing ampicillin resistance, β-lactamases of TEM- or SHV-type were identified, while in cefotaxime resistant strains CTX-M-type β-lactamases, mostly CTX-M-15 were present. A novel next-generation sequencing (NGS) application, called rapid-parallel multilocus sequence typing (RP-MLST) was established and allowed simultaneous sequencing of relevant housekeeping, resistance, target, and resistance-mediating genes in many strains in parallel. Among the E. coli ST131 isolates, DNA-sequencing revealed two not yet described mutations, which could have a FQ-resistance mediating effect. Firstly, mutation acrR fM1, which probably results in the non-translation of acrR, could result in the constitutive expression of the acrAB-encoded MDR-efflux pump AcrAB-TolC. Secondly, mutation ompR A35D may create an additional phosphorylation site in OmpR resulting in an altered activation to OmpR-P influencing the control of the OmpC and OmpF porin regulation. Furthermore, two new alleles of the housekeeping gene pabB have been identified in E. coli isolates. Investigation of the plasmid content of multidrug-resistant E. coli ST131 strains revealed that all harboured at least one plasmid. However, in some strains up to five, some ranging from 60 up to ≥ 100 kbp in size. One clinical E. coli ST131 isolate has been shown to transfer its resistance to ampicillin, gentamicin, and cefotaxime to a susceptible strain. With this the acquirement of plasmids and resistance genes was proven, as well as transfer of multi-resistance. The results contribute to understanding the globally present pathogen E. coli ST131, its pandemic subclones ST131 H30-R and ST131 H30-Rx, the mechanisms underlying its resistance(s) to antibiotics, R-factors and spread of multi-resistance. Furthermore, it provides insights into its spread in the temporal context and its evolution within the ST131 lineage.