Die Knockoutierung von Phosphodiesterasen 2 und 3 in primären Rattenkardiomyozyten mittels CRISPR/Cas9 und Untersuchung derer Funktion

Abstract

Hintergrund: Die zyklischen Nukleotid-Phosphodiesterasen PDE2A und PDE3A spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Kompartimentierung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) sowie beim cGMP-zu-cAMP-crosstalk. Diese PDEs dienen auch als therapeutische Zielmoleküle für kardiale Pathologien wie der Herzinsuffizienz. In gesunden Herzen schützt die PDE2A-Aktivität vor einer Überaktivierung des beta-adrenergen Signalwegs, jedoch führt sie bei Herzpathologien zur Abnahme der Kontraktionskraft. Die Hemmung von PDE3A steigert die Kontraktilität, führt jedoch bei chronischer Gabe zum Anstieg der Mortalität von Patienten mit dekompensierter Herzinsuffizienz. Beide PDEs habe drei verschiedene Isoformen, d. h. PDE2A1-2A3 und PDE3A1-3A3. Die spezifischen Funktionen der Isoformen sind jedoch größtenteils unbekannt, teilweise weil es bisher nicht möglich war, isoformenspezifische Knockout-Mäuse mit konventionellen Methoden zu erzeugen. Durch selektive pharmakologische Modulation könnten theoretisch unerwünschte Effekte der PDE-Inhibitor-Therapie vermieden werden. Diese Arbeit untersuchte, ob das CRISPR/Cas9-Editierungssystem für in-vitro-PDE-Knockouts verwendet werden kann. Ziele der Arbeit: Die Etablierung einer neuen Methode zur schnelleren, kostengünstigeren und weniger tierintensiven Methode zur Erstellung von totalen und spezifischen Isoform-Knockouts in primären Zellen und die Erforschung der Funktion von PDE2A und PDE3A und ihrer Isoformen in Rattenkardiomyozyten. Ergebnisse: Verschiedene PDE2A- und PDE3A-Isoform-spezifische gRNS-Konstrukte wurden entwickelt, kloniert und in adenovirale Expressionsvektoren eingeführt. Adulte und neonatale Rattenkardiomyozyten wurden isoliert, mit verschiedenen Mengen von Adenoviren transduziert (Cas9 in Kombination mit PDE2A- oder PDE3A-gRNS-Konstrukten) und bis zu 6 (adulte) oder 14 (neonatale) Tage kultiviert, um die Dynamik der PDE-Expression durch Western Blot, qPCR und PCR-Sequenzierung des spezifischen Lokus zu analysieren. Es wurden erfolgreich Adenoviren zur Expression von Cas9 in Myozyten hergestellt und die Cas9-Expression durch Immunoblots 2 Tage nach der Transduktion nachgewiesen. Eine optimale "Multiplicity of Infection" (MOI) von 300 (adulte) und 1 (neonatale Kardiomyozyten) wurde durch Tests mit verschiedenen Mengen von Adenoviren ausgewählt. Die Transduktion der Myozyten mit Cas9 und den neu entwickelten PDE-gRNS-Adenoviren führte zu spezifischen Knockouts von PDE2A und PDE3A sowohl bei adulten als auch bei neonatalen Kardiomyozyten. Eine Abnahme der mRNS-Expression von PDE2A (81 ± 2%) und PDE3A (43 ± 8%) wurde 3 Tage nach der Transduktion festgestellt. 6 Tage nach der Transduktion konnten 4% PDE2A und 3,6% PDE3A im Vergleich zu nicht gRNS exprimierenden Zellen in adulten Kardiomyozyten nachgewiesen werden. 14 Tage nach der Transduktion wurde die Proteinexpression in neonatalen Kardiomyozyten auf 54,3% im Fall von PDE2A und 42,5% für PDE3A reduziert. Ein PCR-Sequenzierungsassay zeigte eine Reduktion von Peaks und zusätzliche Peaks im gezielten Lokus bei niedrigem MOI (MOI cas9 1 und MOI gRNS 0,5-10) sowie Deletionen des gezielten Lokus bei höherem MOI (MOI cas9 3-10 und MOI gRNS 3-10) in neonatalen Kardiomyozyten. Messungen von cAMP mittels Förster-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) zeigten eine reduzierte Reaktion auf selektive PDE2- und PDE3-Inhibition in Knockout-Myozyten im Vergleich zu untransduzierten Kontrollzellen sowohl bei adulten als auch bei neonatalen Rattenkardiomyozyten. Außerdem wurde mittels RT-PCR die Expression von PDE2A2 und PDE3A1 Isoformen in neonatalen Kardiomyozyten bestätigt, während keine Expression von PDE2A1, PDE2A3, PDE3A2 und PDE3A3 nachgewiesen werden konnte. In adulten Kardiomyozyten wurde dagegen die Expression von PDE2A1, PDE2A2, PDE2A3 und PDE3A1 bestätigt und keine Expression von PDE3A2 und PDE3A3. Fazit: Unsere Daten zeigen, dass CRISPR/Cas9 ein effektives und praktisches Werkzeug für den In-vitro-Knockout von PDE2A und PDE3A ist. Es kann erwartet werden, dass dieser neue Ansatz zur Erforschung spezifischer Funktionen von PDE-Isoformen beitragen wird und in einer Vielzahl von Experimenten Einsatz finden kann, einschließlich Gen-Editierung humaner Zellen.