Structural studies on ribosomal quality control and antibiotic inhibition during translation initiation

Abstract

Der Translationsstillstand stört den zellulären Proteinsyntheseprozess und führt zu unvollständigen und potenziell schädlichen Proteinprodukten. Um diesem Problem zu begegnen, haben Zellen ribosomenassoziierte Qualitätskontrollmechanismen (RQC) entwickelt, die blockierte ribosomale Komplexe abbauen. Einer der ersten Schritte in diesem Prozess besteht darin, die ribosomalen Untereinheiten zu trennen und die Peptidyl-tRNA von der großen Untereinheit freizusetzen. Während die RQC- Wege in Eukaryonten gut erforscht sind, ist über das bakterielle System noch viel unbekannt.

In Bacillus subtilis haben jüngste Studien gezeigt, dass RqcH und RqcP zusammenarbeiten, um Polyalanin-Schwänze an Peptidyl-tRNA-50S-Komplexe zu binden und sie so für den Abbau zu markieren. Die genauen Faktoren und Bedingungen, die bei der Spaltung dieser blockierten bakteriellen Ribosomen eine Rolle spielen, sind jedoch noch nicht genau bekannt. Im Gegensatz dazu enthält Escherichia coli, dem RqcH fehlt, Hsp15, ein Homolog von RqcP, obwohl beide an unterschiedliche Regionen des Ribosoms binden sollen. In unserer Studie haben wir herausgefunden, dass Hitzeschocks zur Dissoziation von translatierenden Ribosomen führen, wodurch Peptidyl-tRNA-50S-Komplexe entstehen, die Substrate für Hsp15 sind. Wir haben die Struktur des nativen Hsp15-Peptidyl-tRNA-50S- Komplexes mit einer Auflösung von 3,0 Å gelöst und dabei festgestellt, dass Hsp15 ähnlich wie RqcP bindet. Diese Entdeckung steht im Gegensatz zu früheren Berichten, die eine andere Bindungsstelle für Hsp15 in E. coli nahelegen. Darüber hinaus haben wir erste Hinweise darauf gefunden, dass PrfH ein möglicher Kandidat für das Recycling von Hsp15-Peptidyl-tRNA-50S-Komplexen sein könnte.

Wir untersuchten auch die Peptidyl-tRNA-Hydrolase (Pth), die nachweislich das naszierende Peptid aus dem 50S-Peptidyl-tRNA-Komplex während des ribosomalen Abbaus freisetzt. Trotz mehrerer Versuche ist es uns nicht gelungen, die Struktur der an den 50S-Peptidyl-tRNA-Adr1-Komplex gebundenen Pth aufzulösen. Diese Bemühungen bilden jedoch eine Grundlage für künftige Studien und tragen zu einem besseren Verständnis der möglichen Rolle von Pth im Ribosom bei. Ein wesentlicher

Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Initiierung der Translation, den entscheidenden ratenbegrenzenden Schritt der Proteinsynthese. Dieser Prozess wird von mehreren Antibiotika wie Kasugamycin, Edein und dem kürzlich entdeckten Tetrapeptid GE81112 angegriffen. Angesichts der zunehmenden Bedrohung durch Antibiotikaresistenzen ist es von entscheidender Bedeutung zu verstehen, wie diese Inhibitoren funktionieren, was dazu beitragen könnte, ihre Wirksamkeit als antimikrobielle Mittel zu verbessern. In früheren Strukturstudien wurden Kasugamycin, Edein und GE81112 an 30S-Untereinheiten gebunden erfasst, aber diese Strukturen wurden nicht im Zusammenhang mit aktiven Translationsinitiationskomplexen bestimmt, und ihre Auflösung war begrenzt (3,3-13 Å). Darüber hinaus haben Unstimmigkeiten zwischen diesen Strukturen und den zugehörigen biochemischen Daten dazu geführt, dass ihre Mechanismen unklar sind. In dieser Studie haben wir mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) die Strukturen von Kasugamycin, Edein und GE81112, die an 30S- Initiationskomplexe gebunden sind, bei Auflösungen zwischen 2,0 und 2,9 Å aufgelöst. Diese Ergebnisse zeigen unterschiedliche Bindungsstellen für Edein und GE81112 im Vergleich zu früheren kristallographischen Studien. Die hochaufgelösten Strukturen stimmen mit früheren biochemischen Daten überein und bieten neue Einblicke in die molekularen Wechselwirkungen dieser Inhibitoren. Wir fanden heraus, dass Kasugamycin und Edein den 30S-Initiationskomplex einfangen, bevor die Initiator-tRNA die mRNA entschlüsselt, während GE81112 den 30S- Initiationskomplex nach der tRNA-Akkommodation einfängt. Obwohl diese Inhibitoren an eine konservierte Stelle der 30S-Untereinheit binden, blockieren sie aufgrund ihrer unterschiedlichen chemischen Strukturen verschiedene Schritte der Translationsinitiation.

Darüber hinaus untersuchten wir den Hemmungsmechanismus von Streptomycin, das traditionell als Elongationshemmer bekannt ist, während der Translationsinitiation. Die Kryo-EM ergab, dass Streptomycin die Interaktionen zwischen den Initiationsfaktoren IF1 und IF3 stört, was zu einer verstärkten Dissoziation von IF3 von 30S-Initiationskomplexen führt und möglicherweise die Bildung von unproduktiven 70S-Initiationskomplexen beschleunigt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit unser Verständnis der bakteriellen RQC-Mechanismen, insbesondere bei Gram-negativen Bakterien, verbessert hat. Sie wirft auch ein Licht darauf, wie wichtige Inhibitoren auf die Initiierung der Translation abzielen, und liefert Erkenntnisse, die bei der Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen von Nutzen sein könnt

Translational stalling disrupts the cellular protein synthesis process, leading to incomplete and potentially harmful protein products. To address this, cells have developed ribosome-associated quality control (RQC) mechanisms that dismantle stalled ribosomal complexes. One of the first steps in this process involves separating the ribosomal subunits and releasing the peptidyl-tRNA from the large subunit. While the RQC pathways in eukaryotes are well-studied, much remains unknown about the bacterial system.

In Bacillus subtilis, recent studies have shown that RqcH and RqcP function together to attach polyalanine tails to peptidyl-tRNA-50S complexes, marking them for degradation. However, the precise factors and conditions involved in splitting these stalled bacterial ribosomes are not well understood. In contrast, Escherichia coli, which lacks RqcH, contains Hsp15, a homolog of RqcP, although they reportedly bind to different regions of the ribosome. In our study, we found that heat shock leads to the dissociation of translating ribosomes, producing peptidyl-tRNA-50S complexes, which are substrates for Hsp15. We solved the structure of the native Hsp15-peptidyl-tRNA-50S complex at a resolution of 3.0 Å, revealing that Hsp15 binds similarly to RqcP. This discovery contrasts with earlier reports suggesting a different binding site for Hsp15 in E. coli. Additionally, we introduce preliminary evidence suggesting that PrfH may serve as a putative candidate for recycling Hsp15-peptidyl-tRNA-50S complexes.

We also investigated Peptidyl-tRNA hydrolase (Pth), which has been shown to release the nascent peptide from the 50S-peptidyl-tRNA complex during ribosomal disassembly. Despite several attempts, we were unable to resolve the structure of Pth bound to the 50S-peptidyl-tRNA-adr1 complex. However, these efforts provide a foundation for future studies and contribute to a better understanding of Pth’s potential role in the ribosome.

A significant part of this work focuses on translation initiation which is a key rate- limiting step in protein synthesis. This process is targeted by several antibiotics, such

as kasugamycin, edeine, and the recently discovered tetrapeptide GE81112. Given the growing threat of antibiotic resistance, it is essential to understand how these inhibitors function, which could help improve their efficacy as antimicrobial agents. Previous structural studies have captured kasugamycin, edeine, and GE81112 bound to 30S subunits, but these structures were not determined in the context of active translation initiation complexes, and their resolution was limited (3.3-13 Å). Additionally, inconsistencies between these structures and associated biochemical data have left their mechanisms unclear. In this study, using cryo-electron microscopy (cryo-EM), we resolved the structures of kasugamycin, edeine, and GE81112 bound to 30S initiation complexes at resolutions between 2.0 and 2.9 Å. These findings reveal different binding sites for edeine and GE81112 compared to previous crystallographic studies. The high-resolution structures align with prior biochemical data, offering new insights into the molecular interactions of these inhibitors. We found that kasugamycin and edeine trap the pre-initiation 30S complex before the initiator tRNA decodes the mRNA, while GE81112 traps the 30S initiation complex after tRNA accommodation. Despite binding to a conserved site on the 30S subunit, these inhibitors block distinct steps in translation initiation due to their diverse chemical structures.

Additionally, we explored the inhibition mechanism of streptomycin, traditionally known as an elongation inhibitor, during translation initiation. Cryo-EM revealed that streptomycin disrupts interactions between initiation factors IF1 and IF3, leading to absence of IF3 from 30S initiation complexes and potentially accelerating the formation of non-productive 70S initiation complexes.

In conclusion, this body of work advances our understanding of bacterial RQC mechanisms, especially in Gram-negative bacteria. It also sheds light on how key inhibitors target translation initiation, providing insights that could be useful in combating antibiotic resistance.