Adaptor proteins form an interaction network during clathrin-mediated endocytosis

Abstract

Clathrin-mediated endocytosis is a process in eukaryotes that is highly conserved across this domain of life, and is essential for several functions such as receptor internalisation and nutrition. During clathrin-mediated endocytosis, selective assemblies of protein complexes form in specific regions of the membrane, ending in the formation of clathrin-coated vesicles (CCV). Controlling these assemblies are regulatory protein-protein interactions, involving proteins arriving at all time points of the Clathrin-coated pit (CCP) maturation. This includes the mid-coat adaptor protein Sla2, which connects the plasma membrane and the actin cytoskeleton, which is the primary force generator during membrane invagination. The work presented in this thesis presents an interaction network with Sla2 as the central node, and the interacting proteins Clathrin Light Chain (CLC), Sla1, and Pan1 as the primary focus of the biophysically characterised interactions. Sla2, the Fungi homolog, is compared to Hip1R, homolog from Metazoa. The central region of Sla2 is shown to have an additional interaction with CLC not found in Hip1R. This region is also responsible for the regulation of Pan1. Sequence conservation in comparison to Hip1R highlighted the specificity of this Fungi specific interaction with Pan1 and Sla1. The non-conserved region is dominant over the shared region with Hip1R in vivo. The structure, determined by electron cryogenic-microscopy, of the C-terminal region of Sla2 is presented to contextualise these results as the domains detailed here are regulated by the interaction with CLC. The use of AlphaFold3 enabled several key functions of this research: initial model production for structure refinement, protein protein complex prediction, and folded domain annotation for Sla1. This last function narrowed down the most likely interaction site between Sla2 and Sla1 through to the third SH3 domain instead of the other folded domain, which was determined to be a PH domain, which are characterised by the ability to bind phosphatidylinositol. The central region of Sla2 has been shown to also interact with one of the initiator proteins of endocytosis, Ede1. Ede1 phase separates both in vitro and in vivo and we show that Sla2 can be recruited to phase separated droplets. In addition, Sla2 can recruit Clathrin Light Chain and Clathrin Heavy Chain into its own phase separated droplet. These findings fill in details of the regulatory interactions in the endocytic pit, with biophysical and biochemical data, fluorescence microscopy, structural determination by two different methods, AI assisted protein-protein interaction modelling, and in vivo determination of the interaction network surrounding Sla2.

Die Clathrin-vermittelte Endozytose ist ein hochkonservierter Prozess in Eukaryoten und essenziell für verschiedene Funktionen wie die Internalisierung von Rezeptoren und die Nährstoffaufnahme. Während der Clathrin-vermittelten Endozytose bilden sich selektive Protein-Komplexe in spezifischen Bereichen der Membran, was schließlich zur Bildung Clathrin-beschichteter Vesikel (CCV) führt. Die Kontrolle dieser Assemblierungen erfolgt durch regulatorische Protein-Protein-Interaktionen, an denen Proteine beteiligt sind, die zu verschiedenen Zeitpunkten während der Reifung der Clathrin-beschichteten Grube (CCP) eintreffen. Dazu gehört das Mid-Coat-Adapterprotein Sla2, das die Plasmamembran mit dem Aktin-Zytoskelett verbindet, welches die primäre treibende Kraft bei der Membraneinstülpung darstellt. Die in dieser Arbeit vorgestellte Forschung beschreibt ein Interaktionsnetzwerk mit Sla2 als zentralem Knoten und den interagierenden Proteinen Clathrin-Leichtkette (CLC), Sla1 und Pan1 als Hauptfokus der biophysikalisch charakterisierten Interaktionen. Sla2, das homologe Protein in Pilzen, wird mit Hip1R, dem Homolog aus Metazoa, verglichen. Es zeigt sich, dass die zentrale Region von Sla2 eine zusätzliche Interaktion mit CLC eingeht, die in Hip1R nicht vorhanden ist. Diese Region ist zudem für die Regulation von Pan1 verantwortlich. Der Vergleich der Sequenzkonservierung mit Hip1R unterstreicht die Spezifität dieser pilzspezifischen Interaktion mit Pan1 und Sla1. In vivo zeigt sich, dass die nicht-konservierte Region eine dominante Rolle gegenüber der mit Hip1R geteilten Region spielt. Die mittels kryogener Elektronenmikroskopie bestimmte Struktur der C-terminalen Region von Sla2 wird vorgestellt, um diese Ergebnisse in einen strukturellen Kontext zu setzen, da die hier beschriebenen Domänen durch die Interaktion mit CLC reguliert werden. Der Einsatz von AlphaFold3 ermöglichte mehrere zentrale Aspekte dieser Forschung: die Erstellung eines Ausgangsmodells für die Strukturoptimierung, die Vorhersage von Protein-Protein-Komplexen sowie die Annotation gefalteter Domänen in Sla1. Letzteres erlaubte es, die wahrscheinlichste Interaktionsstelle zwischen Sla2 und Sla1 auf die dritte SH3-Domäne einzugrenzen, anstatt auf eine andere gefaltete Domäne, die als PH-Domäne identifiziert wurde – eine Domänenklasse, die für ihre Fähigkeit zur Bindung von Phosphatidylinositol bekannt ist. Zudem wurde gezeigt, dass die zentrale Region von Sla2 mit einem der Initiatorproteine der Endozytose, Ede1, interagiert. Ede1 bildet sowohl in vitro als auch in vivo Phasenseparationen, und wir zeigen, dass Sla2 in diese phasenseparierten Tropfen rekrutiert werden kann. Darüber hinaus kann Sla2 sowohl die Clathrin-Leichtkette als auch die Clathrin Schwerkette in seine eigenen phasenseparierten Tropfen einbinden. Diese Erkenntnisse liefern detaillierte Einblicke in die regulatorischen Interaktionen innerhalb der endozytischen Grube. Sie basieren auf biophysikalischen und biochemischen Daten, Fluoreszenzmikroskopie, struktureller Bestimmung durch zwei verschiedene Methoden, KI-gestütztem Protein-Protein-Interaktionsmodellieren sowie der in vivo-Analyse des Interaktionsnetzwerks um Sla2.