The immunoregulatory role of amphiregulin in acute and chronic liver disease

Abstract

Autoimmune liver diseases such as autoimmune hepatitis (AIH) and primary sclerosing cholangitis (PSC) often progress to fibrosis, cirrhosis and liver cancer. These conditions contribute significantly to patient morbidity and mortality, and treatment options remain limited. Gaining a deeper insight into the cellular and molecular processes in immune-mediated liver diseases is essential for the development of more effective and targeted therapies. The growth factor amphiregulin (AREG) has been shown to contribute to tissue repair and Treg function in acute liver disease, but to fibrogenesis in chronic liver disease. AREG expression is induced in pro-inflammatory group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) and immunosuppressive regulatory T cells (Tregs) in response to the alarmin interleukin (IL)-33, which is released from necrotic hepatocytes following tissue damage. Due to the limited knowledge of the function of AREG produced by these immune cells, this thesis addressed its immunoregulatory role in acute and chronic immune-mediated liver diseases. For this, we used the mouse model of concanavalin (ConA)-induced immune-mediated hepatitis, resembling human acute AIH, and multidrug resistance p-glycoprotein 2 (Mdr2)-/- mice with chronic cholestatic liver disease similar to human PSC.

The presented data demonstrate elevated levels of plasma AREG and hepatic Areg mRNA in immune-mediated hepatitis. Additionally, hepatic Areg mRNA was upregulated in fibrotic Mdr2-/- mice with sclerosing cholangitis. Flow cytometry analysis further revealed increased frequencies of hepatic ILC2s and Tregs expressing the IL-33 receptor suppression of tumorigenicity 2 (ST2) in both ConA- and IL-33-treated mice, as well as in Mdr2-/- mice. In mice treated with ConA or IL-33, hepatic ST2+ ILC2s and ST2+ Tregs showed enhanced activation and AREG expression. In contrast, hepatic ST2+ Tregs from Mdr2-/- mice displayed reduced AREG production and an exhausted phenotype. Also hepatocytes expressed AREG in vitro, but the expression was not upregulated in response to cytokines linked to immune-mediated hepatitis. However, exogenous AREG stimulated Areg mRNA expression in cultured primary hepatocytes in a self-inducing mechanism. The functional role of AREG was further explored in immune-mediated hepatitis. Areg-/- mice exhibited more pronounced ConA-induced liver tissue damage than WT mice, as indicated by elevated plasma levels of the cytosolic liver enzyme alanine aminotransferase (ALT) and increased necrotic areas in H&E-stained liver sections. This was accompanied by a higher activation of hepatic ILC2s and a lower frequency of hepatic ST2+ Tregs. AREG also differentially affected hepatic ILC2s and ST2+ Tregs in vitro. Exogenous AREG reduced the number and activation of hepatic ILC2s, as well as their IL-33-mediated activation. In contrast, exogenous AREG induced the expansion and activation of ST2+ Tregs, but not ST2- Tregs. Interestingly, this stimulatory effect was mediated independently of the epidermal growth factor receptor (EGFR), since its expression levels were similar in ST2+ and ST2- Tregs. Moreover, the activating effect of exogenous AREG was diminished in AREG-deficient ST2+ Tregs, showing that exogenous AREG could not compensate for the lack of intrinsic AREG. Finally, suppression assays demonstrated that the loss of intrinsic AREG also reduced the capacity of Tregs to inhibit CD4+ T cell proliferation. Thus, ST2+ Tregs rely on intrinsic AREG production to maintain their survival, activation, and function through an autocrine mechanism.

Overall, this thesis describes an immunoregulatory role of the ST2+ Treg/AREG axis in immune-mediated liver disease, demonstrating its dual function: supporting the maintenance and immunosuppressive function of ST2+ Tregs while suppressing the effector function of hepatic ILC2s.

Autoimmunbedingte Lebererkrankungen wie die autoimmune Hepatitis (AIH) und die primär sklerosierende Cholangitis (PSC) führen häufig zu Fibrose, Zirrhose und Leberkrebs. Diese Erkrankungen tragen erheblich zur Morbidität und Mortalität der Patienten bei, und die Behandlungsmöglichkeiten sind nach wie vor begrenzt. Ein tieferer Einblick in die zellulären und molekularen Prozesse immunvermittelter Lebererkrankungen ist für die Entwicklung wirksamerer und gezielterer Therapien unerlässlich. Der Wachstumsfaktor Amphiregulin (AREG) trägt in akuten Lebererkrankungen nachweislich zur Gewebereparatur und Treg-Funktion bei, in chronischen Lebererkrankungen jedoch zur Fibrogenese. Die Expression von AREG wird in proinflammatorischen angeborenen lymphoiden Zellen der Gruppe 2 (ILC2s) und immunsuppressiven regulatorischen T-Zellen (Tregs) als Reaktion auf das Alarmin Interleukin (IL)-33 induziert, das nach einer Gewebeschädigung aus nekrotischen Hepatozyten freigesetzt wird. Da die Funktion des von diesen Immunzellen produzierten AREG nur wenig bekannt ist, wurde in dieser Arbeit seine immunregulatorische Rolle in akuten und chronischen immunvermittelten Lebererkrankungen untersucht. Hierzu verwendeten wir das Mausmodell der Concanavalin (ConA)-induzierten immunvermittelten Hepatitis, die der akuten AIH des Menschen ähnelt, und Multidrug-Resistenz P-Glykoprotein 2 (Mdr2)-/- Mäuse mit chronischer cholestatischer Lebererkrankung, die Merkmale der menschlichen PSC aufweist.

Die vorgestellten Daten zeigen erhöhte Spiegel von Plasma-AREG und hepatischer Areg-mRNA in immunvermittelter Hepatitis. Außerdem war die hepatische Areg-mRNA in fibrotischen Mdr2-/- Mäusen mit sklerosierender Cholangitis hochreguliert. Durchflusszytometrie-Analysen zeigten zudem eine erhöhte Häufigkeit von hepatischen ILC2s und Tregs, die den IL-33-Rezeptor Suppression der Tumorigenität 2 (ST2) exprimieren, in ConA- und IL-33-behandelten Mäusen als auch in Mdr2-/- Mäusen. In Mäusen, die mit ConA oder IL-33 behandelt wurden, wiesen hepatische ST2+ ILC2s und ST2+ Tregs eine erhöhte Aktivierung und AREG-Expression auf. Im Gegensatz dazu zeigten hepatische ST2+ Tregs aus Mdr2-/- Mäusen eine verminderte AREG-Produktion und einen erschöpften Phänotyp. Auch Hepatozyten exprimierten AREG in vitro, jedoch wurde die Expression nach der Stimulation mit Zytokinen, die mit immunvermittelter Hepatitis in Verbindung stehen, nicht hochreguliert. Exogenes AREG hingegen stimulierte die Expression von Areg-mRNA in kultivierten primären Hepatozyten über einen selbstinduzierenden Mechanismus. Die funktionelle Rolle von AREG wurde im Weiteren in der immunvermittelten Hepatitis untersucht. Areg-/- Mäuse wiesen eine ausgeprägtere ConA-induzierte Schädigung des Lebergewebes auf als WT-Mäuse, was sich in erhöhten Plasmaspiegeln des zytosolischen Leberenzyms Alanin-Aminotransferase (ALT) und vermehrten nekrotischen Bereichen in H&E-gefärbten Leberschnitten zeigte. Dies ging mit einer stärkeren Aktivierung der hepatischen ILC2s und einer verringerten Häufigkeit hepatischer ST2+ Tregs einher. AREG hatte auch in vitro unterschiedliche Effekte auf hepatische ILC2s und ST2+ Tregs. Exogenes AREG reduzierte die Anzahl und Aktivierung der hepatischen ILC2s sowie deren IL-33-vermittelte Aktivierung. Im Gegensatz dazu induzierte exogenes AREG die Expansion und Aktivierung von ST2+ Tregs, aber nicht von ST2- Tregs. Interessanterweise wurde diese stimulierende Wirkung unabhängig vom epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) vermittelt, da dessen Expressionsniveau in ST2+ und ST2- Tregs ähnlich war. Darüber hinaus war die aktivierende Wirkung von exogenem AREG in AREG-defizienten ST2+ Tregs vermindert, was zeigt, dass exogenes AREG den Mangel an intrinsischem AREG nicht kompensieren konnte. Schließlich demonstrierten Suppressionsassays, dass der Verlust von intrinsischem AREG auch die Fähigkeit der Tregs verringerte, die Proliferation von CD4+ T-Zellen zu hemmen. Somit sind ST2+ Tregs auf die intrinsische Produktion von AREG angewiesen, um ihre Überlebensfähigkeit, Aktivierung und Funktion durch einen autokrinen Mechanismus aufrechtzuerhalten.

Insgesamt beschreibt diese Dissertation eine immunregulatorische Rolle der ST2+ Treg/AREG-Achse in immunvermittelten Lebererkrankungen und zeigt ihre duale Funktion auf: Sie unterstützt die Erhaltung und immunsuppressive Funktion der ST2+ Tregs und unterdrückt gleichzeitig die Effektorfunktion der hepatischen ILC2s.