Futtermittelauthentifizierung: Bewertung metabolombasierter Ansätze zur geografischen Klassifizierung am Beispiel von Körnermaisproben

Abstract

Die Rückverfolgbarkeit von Waren, insbesondere Lebensmitteln und Futtermitteln wird zunehmend relevanter, vor allem da der Handel und die Lieferketten im Zuge der Globalisierung immer komplexer werden. Körnermais als wichtiges Futtermittel ist besonders anfällig für betrügerische Umdeklarationen der Warenherkunft. Der Handelsmarkt für Körnermais ist international, gleichzeitig beeinflusst der Anbauort nicht nur die ernährungsphysiologische Qualität des Futtermittels, sondern ist auch ein Risikofaktor für eine Kontamination mit Mykotoxinen. Heutzutage erfolgt die Verifikation des Anbaulandes jedoch immer noch hauptsächlich über Lieferdokumente. Folglich ist eine objektive analytische Verifikation des Anbauortes von Körnermais erforderlich. Insbesondere die Analyse des Metaboloms (Gesamtheit aller Stoffwechselprodukte) erscheint naheliegend, da dieses dem Phänotyp am nächsten ist und somit empfänglich für Umwelteinflüsse ist. Daher wurde die Möglichkeit der Herkunftsverifikation von Körnermaisproben in dieser Arbeit untersucht. Hierfür kamen zwei analytische Verfahren zum Einsatz: die flüssigkeitsgekoppelte Massenspektrometrie (LC-MS) sowie die Fourier-transformierte Nahinfrarotspektroskopie (FT-NIR-Spektroskopie). Um sicherzustellen, dass die beobachteten Unterschiede von der unterschiedlichen geographischen Probenherkunft herrührten und nicht aus Sortenunterschieden resultierten, wurden insgesamt 81 Proben aus Landessortenversuchen analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass – im Einklang mit der Literatur – der Einfluss der Herkunft mit im Mittel 12.0-25.6 % viel bedeutsamer ist, als jener der Sorte mit lediglich 7.8-9.1 % beeinflussten Features. Bei der Analytik mittels FT-NIR-Spektroskopie stellte sich eine Vermahlung der Körnermaisproben als vorteilhaft heraus. Insgesamt wurden 101 Proben aus fünf unterschiedlichen Ländern analysiert. Mittels statistischer Tests und multivariater Datenanalyse wurden herkunfts-spezifisch beeinflusste Bereiche der FT-NIR-Spektren identifiziert. Diese entsprachen den Absorptionsbanden von Proteinen, Stärke sowie Lipiden. Diese Bereiche des Spektrums wurden zur Klassifikation mittels des Support-Vector-Machines-Algorithmus mit einer linearen Kernelfunktion genutzt, wobei eine Erfolgsrate von 94.7 % mittels Kreuzvalidierung (10 folds, 100 Wiederholungen) erreicht wurde. Die Robustheit der Methode wurde zudem überprüft, indem weitere 72 Proben aus Frankreich und Ungarn analysiert wurden, die mittels eines anderen Verfahrens vermahlen und zudem für 24 h gefriergetrocknet wurden. Im Falle der LC-MS-Analytik wurden insgesamt 151 Proben aus sieben unterschiedlichen Ländern untersucht. Um das Körnermais-Metabolom analytisch zu erfassen, wurden zunächst zwei Methoden für die Extraktion von polaren bzw. unpolaren Metaboliten optimiert. Dabei zeigte sich, dass polare Metabolite bevorzugt mittels einer Mischung aus Methanol und Wasser (2:1 v/v) extrahiert werden konnten, während unpolare Metabolite optimaler Weise mittels einer Bligh & Dyer-basierten Extraktionsmethode abgedeckt wurden. Mittels statistischer Tests und multivariater Datenanalyse wurden herkunfts-spezifisch beeinflusste Features in den LC-MS-Daten der unpolaren Metabolite, welche im positiven Ionenmodus detektiert werden konnten, ermittelt. Dieses Subset des Metaboloms erwies sich sowohl als sehr abundant, als auch gleichzeitig am robustesten gegenüber eventuellen Sorteneinflüssen. Folglich wurde diese Methode zur analytischen Herkunftsverifikation herangezogen. Mittels statistischer Tests und multivariater Datenanalyse wurden 20 herkunfts-spezifisch beeinflusste Features in den LC-MS-Analysen identifiziert. Die Klassifizierung mittels Random-Forest-Algorithmus erzielte dabei eine Erfolgsrate von 90.5 % in der Kreuzvalidierung (10 folds, 100 Wiederholungen). Die Markersubstanzen wurden als Lipide identifiziert, die den Klassen der Phospholipide sowie den Di- und Trigylceriden angehörten. Die prinzipielle Eignung der zuvor mittels hochauflösender LC-MS-Analyse auf der Ebene der unfragmentierten Analyten (MS1-Ebene) halb-quantitativ detektierten Markermetabolite wurde für ein Subset von neun Markern ebenfalls quantitativ auf MS2-Ebene verifiziert. Dabei wurden kongruente Klassifizierungs-ergebnisse erhalten. Die Robustheit der 20 identifizierten Markersubstanzen, wurde zudem ausführlich untersucht. Insbesondere wurden die Metabolite in Hinblick auf ihre Lagerungsstabilität der erstellten Extrakte verifiziert. Schließlich wurde eine Datenfusion, der mittels der beiden Analysemethoden erhobenen Daten durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass eine Fusion der Analysedaten auf low-level Ebene zu besseren Klassifizierungsergebnissen mittels des Random-Forest-Algorithmus führte (97.3 % für die Fusion der 20 LC-MS-Metabolite und der 216 spezifischen Wellenzahlen der FT-NIR-Spektren), als die jeweiligen Einzelmethoden. Dieses Ergebnis unterstreicht die Möglichkeit der Optimierung eines Klassifikationsmodells durch die Nutzung zweier zueinander orthogonaler Analysenmethoden.

The traceability of goods, especially food and feed, is an emerging topic, as trade and supply chains are more and more complex in a globalized market. Especially grain maize is prone to fraud regarding the origin of growth: The market for maize is internationalized and the growth location could not only influence the quality of grain maize, but also influence the risk of mycotoxin contamination. Today, this verification of the origin is mainly done by checking shipping documents, which may be distorted. In conclusion there is a high need of analytical methods for verification e. g. to be able to objectively trace back the origin of feed samples. Analyzing the metabolome for origin verification is straightforward, as it is closest to the phenotype and therefore, very sensitive to environmental influences. Therefore, the ability of analytical methods for a verification of the geographical origin of grain maize is accessed in this work. Two analytical methods, liquid chromatography online-coupled to mass spectrometry (LC-MS) as well as Fourier-transformation near-infrared spectroscopy (FT-NIR spectroscopy) were used. To assure that the observed variations were caused by differences of growth origin (and not by varietal differences) in total 81 samples of varietal trials were analyzed first. It could be shown, that in accordance with literature the influence of the geographical location of the growth origin had a much bigger influence (mean 12.0-25.6 vs. 7.8-9.1 % regulated features by origin resp. variety). For FT-NIR spectroscopy, it was also found that the preferred sample form for the NIR beam is a ground sample. In total, 101 samples from five different countries were measured by FT-NIR spectroscopy for building an origin differentiation model. By using multivariate data analysis specific marker bands suitable for determining the origin of grain maize could be identified, which were located in the regions of absorbance of proteins, starches and lipids. Classification algorithms showed a successful rate of 94.7 % in a 100 times repeated 10-fold cross-validation support vector machines classification using a linear kernel function. The robustness of the method was further accessed by measuring another 72 samples from France and Hungary, which were prepared by a different mill and lyophilized afterwards. In case of LC-MS analysis, 151 samples from seven different countries were considered. To assure that the metabolome was optimal covered first two extraction methods were first optimized for maximum coverage. It turned out, polar metabolites of grain maize are preferently extracted using a mixture of methanol and water (2:1 v/v), while non-polar metabolites are best covered by using a Bligh & Dyer-based extraction method. By using multivariate data analysis 20 promising specific marker features could be identified by means of LC-MS analysis from non-polar metabolites detected in the positive ion mode. Classification of statistical relevant markers using random forest algorithm showed a successful rate of 90.5 % in a 100 times repeated 10-fold cross-validation. The robustness of the model to different varieties was tested, as well as its performance when the number of marker features is downscaled to be more feasible to use. The selected markers were identified to belong to the class of triglycerides, diglycerides and phospholipids. The feasibility of these marker substances in terms of a quantitative analysis were exemplary conducted for a subset of nine marker substances, which resulted in comparable classification results. The robustness of the 20 identified marker metabolites was carefully analyzed. In particular, the stability of the extracts obtained was investigated. Finally, the data obtained by the two analytic methods were also combined to a low-level fusion classification model. Using this strategy correct classification results of 97.3 % (using fused data of 20 LC-MS marker substances and 216 wavenumbers of FT-NIR spectra) could be achieved using the random forest algorithm, which performed better than the respective analytical methods without combination. These results underline the possibility of optimization of a classification model by the combined usage of two different orthogonal analytical approaches.