Influence of a Selenium Biofortification of Apples (Malus Domestica BORKH.) on Nutrionally Important Metabolites of Primary and Secondary Plant Metabolism

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss einer Selen-Biofortifikation von Äpfeln auf ernährungsphysiologisch wichtige Metaboliten des primären und sekundären Pflanzenstoffwechsels analysiert. Von besonderer Bedeutung waren dabei der Gehalt an dem Spurenelement Selen, die qualitative und quantitative Zusammensetzung der phenolischen Verbindungen und die mit letzteren verbundenen Eigenschaften. Dazu gehören die Aktivität der Polyphenoloxidase (PPO), die eine wichtige katalytische Rolle beim oxidativen Abbau von phenolischen Verbindungen und deren antioxidativen Eigenschaften spielt. Im Hinblick auf den primären Pflanzenstoffwechsel waren auch allergene Proteine von Bedeutung, die als antinutritive Bestandteile eingestuft werden. Aufgrund der ernährungsphysiologischen Bedeutung und Wirkung ist ein hoher Gehalt an Selen und phenolischen Verbindungen und ein geringer Gehalt an allergenen Proteinen in Äpfeln wünschenswert. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass dies durch die Anwendung der agronomischen Biofortifikation, einer gezielten Düngungsmethode, mit Selen erreicht werden könnte. Zu diesem Zweck wurden Apfelproben von sieben verschiedenen Sorten angebaut und über eine Blattdüngung mit Selen in verschiedenen Applikationsformen und -mengen biofortifiziert. Dies ermöglicht die Auswahl der optimalen Düngungsmethode und es kann überprüft werden, welche Sorten mehr oder weniger geeignet sind, um die Ziele zu erreichen. Darüber hinaus konnten durch den Anbau in drei aufeinanderfolgenden Jahren an zwei Standorten ökophysiologische Faktoren als weiterer Einflussfaktor auf die Inhaltsstoffe der Äpfel identifiziert werden. Für die Analyse der Polyphenoloxidase-Aktivität, des Gesamtphenolgehaltes nach FOLIN-CIOCALTEU (TPC), der antioxidativen Aktivität (AOA) mittels Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) und oxygen radical absorbance capacity (ORAC) Test sowie der Messung des Proteingehaltes nach BRADFORD wurden photometrische Methoden für die Matrix Apfel und die daraus erhaltenen Apfelextrakte etabliert und validiert. Außerdem wurde eine Extraktionsmethode für phenolische Verbindungen aus Äpfeln entwickelt und optimiert. Für die Extraktion der Proteine sowie für die gelelektrophoretische Auftrennung der gewonnenen Extrakte mittels diskontinuierlicher Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese disk-SDS-PAGE) wurde ebenfalls eine Methode entwickelt und optimiert. Für die quantitative Bestimmung des Gehalts des Hauptallergens Mal d 1 in den Früchten wurde ein direkter Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) entwickelt. Hochleistungsflüssigkeits-chromatographie mit Diodenarray-Detektor gekoppelt mit Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (HPLC-DAD-ESI-MSn) wurde zur Identifizierung und Quantifizierung der phenolischen Verbindungen eingesetzt, und die Identifizierung der allergenen Proteine erfolgte nach einem In-Gel-Verdau durch Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisierungs-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-ESI-qTOF-MS) und Flüssigchromatographie im Nanomaßstab gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (nanoLC-MS/MS). Die Analyse des Selengehalts wurde von einem Projektpartner mittels Graphitrohr-Atomabsorptions-spektroskopie (GF-AAS) durchgeführt. Der Selengehalt in den Äpfeln wurde durch die Biofortifikation signifikant um einen Faktor zwischen 10 und 40 auf Gehalte von 2,1 bis 23,2 µg/100 g Frischmasse erhöht. Somit kann der Verzehr von selenbiofortifizierten Äpfeln wesentlich zu einer besseren Selenversorgung der Bevölkerung beitragen. Ein mittelgroßer Apfel kann etwa ein Viertel des täglichen Selenbedarfs eines Erwachsenen decken, dieser beträgt 70 µg für Männer und 60 µg für Frauen. Die eingesetzte Selenform spielte für den Selengehalt in den Äpfeln keine wesentliche Rolle. Aufgrund der beobachteten Fruchtschäden bei der Anwendung von Selenit wird jedoch das pflanzenverträglichere Selenat für zukünftige Anwendungen bevorzugt. Die Biofortifikation führte zu geringeren Schwankungen in der PPO-Aktivität. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Höhe der Selenanwendung die Enzymaktivität beeinflusst. Hier wurden höhere Anwendungsmengen mit höheren PPO-Aktivitäten in Verbindung gebracht. Die PPO-Aktivität stand im Zusammenhang mit dem TPC, da dieses Enzym den Abbau von Phenolverbindungen katalysiert. Bei höherem Seleneinsatz wurde ein geringerer TPC gemessen, was sich durch die höhere PPO-Aktivität erklären lässt, durch die mehr phenolische Verbindungen oxidiert werden. In Bezug auf die AOA zeigte die Biofortifikation keine klaren Trends. Dies hängt wahrscheinlich mit den unterschiedlichen antioxidativen Aktivitäten der einzelnen Phenolverbindungen zusammen. Die in der vorliegenden Arbeit analysierten Äpfel enthalten vor allem Chlorogensäure mit einem Gehalt von bis zu 40 % sowie Epicatechin und hohe Mengen verschiedener Quercetin-Glycoside und Phloretin-Glucoside. Die Biofortifikation zeigte bei den Sorten 'Fiesta', 'Jonica', 'Golden Delicious' und 'Jonagold' zum Teil unterschiedliche Wirkungen in Bezug auf den Gehalt und den Anteil der einzelnen phenolischen Verbindungen. In den meisten Fällen wurde ein signifikanter Anstieg von Epicatechin und Caffeeoylglucosid und eine Verringerung von Procyanidintrimer beobachtet. Die vier allergenen Proteine Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3 und Mal d 4 wurden in den Äpfeln durch disk. SDS-PAGE und nanoLC-MS/MS identifiziert. Die Proteinmuster der verschiedenen Apfelproben sind grundsätzlich ähnlich, unterscheiden sich aber in der Intensität der Proteinbanden, was auf unterschiedliche Gehalte der einzelnen allergenen Proteine hinweist. Zur Bestimmung der Lokalisierung der verschiedenen allergenen Proteine wurden getrennte Analysen von Schale und Fruchtfleisch durchgeführt. So zeigte sich, dass die Schale besonders reich an Mal d 3 ist, während Mal d 2 hauptsächlich im Fruchtfleisch zu finden ist. Mal d 1 wurde sowohl in der Schale als auch im Fruchtfleisch gefunden. In Bezug auf alle gemessenen Parameter wurden die Apfelsorte und ökophysiologische Bedingungen wie die Sonnenscheindauer als weitere Einflussfaktoren identifiziert. Korrelationsanalysen wurden durchgeführt, um die Beziehung zwischen phenolischen Verbindungen und dem Mal d 1-Gehalt zu analysieren. Es wurde festgestellt, dass die PPO-Aktivität und der Gehalt an einzelnen phenolischen Verbindungen mit dem Mal d 1-Gehalt korrelierten. Die Beziehung zwischen der PPO-Aktivität und dem Mal d 1-Gehalt schien sowohl sortenabhängig als auch von den ökophysiologischen Bedingungen beeinflusst zu sein, da sowohl positive als auch negative Korrelationen festgestellt wurden. Niedrigere Mal d 1-Gehalte wurden bei Äpfeln mit vergleichsweise hohem Chlorogensäuregehalt und niedrigem Procyanidintrimer- und Epicatechingehalt beobachtet. Der Gesamtphenolgehalt und das Niveau der antioxidativen Aktivität scheinen dagegen nur eine untergeordnete Rolle zu spielen. Es wurde auch eine Korrelation zwischen dem Selen- und dem Mal d 1-Gehalt und damit ein Einfluss der agronomischen Düngung festgestellt. Ein hoher Selengehalt war mit einem niedrigen Mal d 1-Gehalt verbunden. Darüber hinaus wurden bei den biofortifizierten Äpfeln häufig die oben erwähnten Veränderungen im Phenolprofil beobachtet, die mit einer geringen Allergenität einhergingen. Somit scheint diese Maßnahme geeignet zu sein, das allergene Potenzial von Äpfeln zu reduzieren.