Pathogenicity of UCH-L1 autoantibodies in membranous nephropathy

Abstract

The autoimmune disease membranous nephropathy (MN), affects podocytes, specialized cells of the kidney, which contribute to the filtration of the blood and the secretion of glomerular basement membrane (GBM) components. MN is caused by primary autoantibodies directed against foot process (FP) proteins such as THSD7A, binding their target antigen and accumulating as immune complexes along the glomerular filtration barrier (GFB). In the past years next to the primary autoantibodies a multitude of putative MN-associated autoantibodies were discovered, which among others are directed to intracellular proteins and might occur as a secondary immune response. Altghough their relation to MN pathogenesis is unclear, MN patients with secondary autoantibodies against intracellular proteins are linked to a poor clinical outcome. A subset of MN patients presents with secondary autoantibodies directed against the intracellular deubiquitinating enzyme Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1 (UCH-L1), which is de novo expressed in injured podocytes. Hypothesis of the current work is that secondary anti-UCH-L1 antibodies lead to a worsening of MN either through their presence at the GFB or by interference with UCH-L1 functionality. To investigate the pathogenicity of those secondary antibodies in MN, experiments were performed in established human podocyte cell culture and THSD7A-MN mouse models. After MN induction, secondary anti-UCH-L1 antibodies were applied to achieve a second hit (THSD7A-MN+2nd hit). For pathogenicity, antibodies need to have access to the antigen, which could be verified through a foot process/plasma membrane localization of UCH-L1 in the THSD7A-MN setting. The THSD7A-MN+2nd hit led to an aggravation of the disease, demonstrated by increased proteinuria and a worsening of FP effacement. Mechanistically 2nd hit anti-UCH-L1-abs exhibited pathogenicity through a higher antibody load at the GFB, especially within the glomerular immune complex containing protein fraction. Additionally, GBM synthesis was dysregulated with a shift in collagen IV α-chain synthesis towards a form expressed by podocytes during GBM development. Furthermore, protein amounts of UCH-L1 were elevated in THSD7A-MN+2nd hit and showed aggregates in podocytes. Investigations in podocyte cell culture medium as well as human and mouse urine were significant for an increased release of THSD7A antibody loaded extracellular vesicles (EVs). Those EVs furthermore contained non-functional UCH-L1, next to proteolytically processed THSD7A, demonstrating that EVs represent a potential exit route for MN antigens. This could potentially represent a first step towards antigen-spreading in MN. In conclusion anti-UCH-L1 antibodies aggravate clinical and morphologic podocyte injury by contributing to GFB damage and binding membrane-bound UCH-L1. This work contributes to a more detailed understanding of factors leading to a poor clinical outcome of MN and demonstrate the necessity for investigations on other putative secondary antigens.

Die Membranöse Nephropathie (MN) ist eine Autoimmunerkrankung der Niere, welche Podozyten, spezialisierte Zellen der Niere, betrifft. Diese sind an der Filtration des Blutes und der Synthese der glomerulären Basalmembran beteiligt. Die MN wird durch primäre Autoantikörper gegen Podozytenantigene wie THSD7A, welche an den Fußfortsätzen exprimiert werden, ausgelöst. Die entstehenden Immunkomplexe werden entlang der glomerulären Filtrationsbarriere abgelagert und führen zu einer Zerstörung der glomerulären Filtrationsbarriere. In den letzten Jahren wurden neben den primären Autoantikörpern weitere MN-assoziierte Autoantikörper identifiziert, die unter anderem gegen intrazelluläre Proteine gerichtet sind und vermutlich als sekundäre Immunreaktion auftreten. Es ist unklar, ob diese zur Pathogenität der MN beitragen, allerdings zeigen MN-Patienten, die solche sekundären Autoantikörper aufweisen, eine Verschlechterung des Krankheitsverlaufs. Einige MN-Patienten weisen spezifisch Autoantikörper gegen das in geschädigten Podozyten de novo exprimierte, intrazelluläre deubiquitinierende Enzym Ubiquitin C-terminale Hydrolase L1 (UCH-L1) auf. Hypothese dieser Arbeit ist, dass diese sekundären anti-UCH-L1 Antikörper durch ihre Präsenz an der glomerulären Filtrationsbarriere oder durch die Beeinflussung der UCH-L1 Protein Aktivität, zu einer Verschlechterung der MN führen. Um die Pathogenität sekundärer anti-UCH-L1 Antikörper im Zusammenhang mit der MN zu untersuchen, wurden Versuche in etablierten humanen Zellkulturpodozyten und Maus Modellen der THSD7A-MN durchgeführt. Nach MN-Entwicklung wurden anti-UCH-L1 Antikörper als sekundäre Behandlung appliziert (THSD7A-MN+2nd hit). Um einen pathogenen Einfluss zu haben, müssen Antikörper Zugang zu dem entsprechenden Antigen haben. Dies konnte in MN-Patienten und dem THSD7A-MN Maus Modell durch die Lokalisierung an der Podozytenfußfortsatzmembran gezeigt werden. Die Applizierung des sekundären anti-UCH-L1 Antikörpers führte zu einem verschlechterten Krankheitsverlauf mit verstärkter Proteinurie und Fußfortsatzverschmelzung. Morphologisch-funktionell zeigten THSD7A-MN+2nd hit Mäuse zudem eine erhöhte Antikörper Last an der glomerulären Filtrationsbarriere und eine Veränderung in der Kollagen IV Produktion hin zu einer Form, welche nur im sich entwickelnden Glomerulus vorkommt. Weiterhin wurde beobachtet, dass der podozytäre UCH-L1 Gehalt anstieg und das Protein in Podozyten aggregierte. Mittels Zellkultur- und Urinuntersuchungen konnte eine vermehrte Abgabe von Extrazellularvesikeln gezeigt werden, welche mit anti-THSD7A Antikörpern beladen sind. Zusätzlich enthielten die Extrazellularvesikel nicht-funktionales UCH-L1 ebenso wie ein proteolytisch gespaltenes THSD7A, wodurch Extrazellularvesikel eine mögliche Austrittspforte für geschädigte Antigene darstellen. Zusammenfassend gibt die zugrundeliegende Arbeit gibt einen ersten Hinweis auf einen krankheitsverschlechternden Einfluss der sekundären anti-UCH-L1 Antikörper und trägt zu einem besseren Verständnis der Faktoren bei, welche zu einer Verschlächterung der MN führen. Sie zeigt somit auch die Notwendigkeit weitere mögliche (sekundäre) Antigene und ihren Einfluss zu untersuchen.