LC-MS/MS-basierte Proteomanalyse der Auswirkungen pathogener HRAS-Varianten auf humane Keratinozyten

Abstract

Die kleine GTPase HRAS ist ein wichtiges Signalprotein, das an der epidermalen Homöostase beteiligt ist. Mutationen in HRAS führen zu Aminosäuresubstitutionen, welche weitreichende Auswirkungen haben und zum Beispiel zu Hauterkrankungen führen. Pathogene Keimbahnvarianten verursachen die nicht-mosaische RASopathie Costello-Syndrom (CS), eine seltene Entwicklungsstörung, die auch die Haut betrifft und bei >80 % der CS-Patienten mit der Variante HRASGly12Ser assoziiert ist. Postzygotische Mutationen führen zu sogenannten mosaischen RASopathien, wie dem Nävus-Sebaceus-Syndrom, bei dem >85 % der Patienten die Variante HRASGly13Arg aufweisen. Zudem findet sich die onkogene Variante HRASGly12Val häufig in dermatologischen und anderen malignen Erkrankungen.

Alle HRAS-Varianten führen zu einer konstitutiven Aktivierung, jedoch bewirken sie jeweils unterschiedliche epidermale Phänotypen mit spezifischen molekularen Veränderungen. Um diese Effekte zu untersuchen, wurde die permanente humane Keratinozyten-Zelllinie HaCaT herangezogen, welche wichtige epidermale Eigenschaften wie die Fähigkeit zur Differenzierung beibehält. HaCaT-Zellen, die stabil verschiedene HRAS-Varianten exprimieren, wurden mittels LC-MS/MS-basierter Bottom-Up-Proteomik analysiert. Ko-Immunpräzipitation (Ko-IP) in Kombination mit LC-MS/MS diente zur Untersuchung von Protein-Interaktionspartnern, gefolgt von Analysen des Gesamtzell-Proteoms und des Phosphoproteoms zur Bestimmung der Änderungen von Proteinabundanzen und Phosphorylierungsmustern.

Signifikante Unterschiede wurden auf allen Ebenen festgestellt: im Interaktom, im Proteom und im Phosphoproteom. Alle Varianten führten zu einer verstärkten Interaktion zwischen HRAS und bekannten RAS-Effektorproteinen wie RAF1, RIN1 und MLLT4/AFDN, was einige Veränderungen im (Phospho-)Proteom bewirkte. Insgesamt verursachte HRASGly13Arg die ausgeprägtesten Verschiebungen im Interaktom, wobei mehrere hundert Proteine signifikante Veränderungen in ihrer Abundanz zeigten. Auch deutliche Veränderungen im Proteom und im Phosphoproteom wurden beobachtet, darunter die Aktivierung der Zytoskelett-Reorganisation, des Vesikel-mediierten Transports, des Immunsystems sowie der Apoptose. Die Variante HRASGly12Ser bewirkte eine weniger ausgeprägte Veränderung des Interaktoms und zeigte entsprechend geringere Auswirkungen auf das (Phospho-)Proteom. RAS-RAF-MAPK-Signaling und Apoptose wurden verstärkt, während Zytoskelett-Signaling beeinträchtigt war. HRASGly12Val führte zu einer erhöhten Reorganisation des Zytoskeletts, verstärktem RAS-RAF-MAPK-Signaling und vermehrten Zelloberflächeninteraktionen, während intrazelluläres Signaling herunterreguliert wurde.

Alle Varianten hatten Gemeinsamkeiten, wie Änderungen der zellulären Architektur und Dynamik, aber auch eine Beeinträchtigung der Genexpression und Transkription sowie Störungen der epidermalen Homöostase. Nichtsdestotrotz führten alle HRAS-Varianten zu einem individuellen Proteomprofil, was die Bedeutung der Investigation jeder einzelnen Varianten-assoziierten Pathologie unterstreicht.

Insgesamt liefert diese Studie wertvolle Einblicke in die durch HRAS-Mutationen verursachten Veränderungen im Proteom und hebt hervor, welche Verschiebungen in Signalwegen und zellulären Prozessen den Krankheiten zugrunde liegen.