Functional role of the immunoproteasome in (glomerular) endothelial cells

Abstract

The proteasome as the catalytic complex of the ubiquitin proteasome system (UPS) plays a central role in cellular proteostasis. The immunoproteasome as a specialised form of the proteasome was originally described in the context of immune cells and cellular stress. However, it is increasingly recognised that endothelial cells (EnCs) express immuno-proteasomal subunits even under homeostatic conditions. Nevertheless, the functional relevance of this expression is so far hardly described. Therefore, a new mouse line allowing the endothelial specific knockout of the immunoproteasomal subunit LMP7 (LMP7ΔEnC) was established. EnCs isolated from glomerular, peritubular, heart, liver and lung tissue exhibited a robust loss of LMP7 as well as an upregulation of the corresponding constitutive subunit β5c and a loss of cell surface MHC class I. Interestingly, kidney EnCs appeared to be more strongly affected by the loss of LMP7 than EnCs from other organs. As such, kidney EnCs increased both in cell size and granularity and peritubular EnCs (PtEnCs) also exhibited reduced MHC class II levels, whereas immunoglobulin G (IgG) accumulated in glomerular endothelial cells. Additionally, the glomerular filtration barrier (GFB) showed a strongly altered ultrastructure with loss of endothelial fenestrations and podocyte foot process effacement. This was in stark contrast to the lack of albuminuria observed in these mice under basal conditions, a classical marker of GFB impairment. The higher granularity of EnCs together with the altered cell surface levels of several proteins and differences in msIgG handling indicate an impairment of the endocytic pathway by the loss of endothelial immunoproteasome. Untargeted analyses of both mRNA and protein levels in endothelial cells isolated from LMP7ΔEnC mice and control littermates allowed the identification of possible mechanisms behind the observed phenotypic cellular alterations. MORF4L2 was identified as a potential immunoproteasome specific substrate. Potential involvement of the endothelial immunoproteasome in disease conditions was analysed using the BTBR ob/ob mouse model of diabetic nephropathy (DN) and the nephrotoxic nephritis (NTN) model of crescentic glomerulonephritis (cGN). In BTBR ob/ob mice, alterations in (immuno)proteasomal subunit expression could be observed, most strongly in EnCs and podocytes of the glomerulus. Increased levels of immunoproteasomal catalytic subunits did not relate to a higher proteasomal activity, which in contrast was rather impaired. Surprisingly, no accumulation of proteasomal substrates like K48-polyubiquitinated proteins could be observed. Mechanistic studies employing the NTN model of cGN in LMP7ΔEnC mice indicated a protective effect of the endothelial immunoproteasome in immune-mediated glomerular disease. As such, knockout animals exhibited an exacerbated clinical and morphologic disease course with higher albuminuria, worse serum parameters and increased crescent formation. Both glomerular endothelial cells and podocytes showed a higher susceptibility to stress in the absence of LMP7. The data presented here highlight the functional relevance of endothelial immunoproteasome expression under homeostatic conditions and offer interesting insights into the mechanisms. The observed organotypic reactions and the involvement of endothelial LMP7 in disease provide promising starting points for further study.

Das Proteasom spielt als katalytischer Komplex im Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) eine zentrale Rolle für die zelluläre Proteostase. Das Immunoproteasom als spezielle Form des Proteasoms wurde bisher vor allem im Kontext des Immunsystems und zellulärem Stress beschrieben. Es wird jedoch zunehmend deutlich, dass Endothelzellen immunoproteasomale Untereinheiten auch unter homöostatischen Bedingungen exprimieren. Die funktionale Relevanz dieser Expression ist bisher jedoch kaum erforscht. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit eine neue Mauslinie etabliert, die den endothelzellspezifischen Knockout der immunoproteasomalen Untereinheit LMP7 erlaubt (LMP7ΔEnC). Isolierte glomeruläre, peritubuläre, Herz-, Leber- und Lungenendothelzellen zeigten einen vollständigen Verlust an LMP7 sowie deutlich höhere Level der korrespondierenden konstitutiven Untereinheit β5c und einen Verlust von MHC Klasse I - Molekülen auf der Zelloberfläche. Interessanterweise schienen Nierenendothelzellen empfindlicher auf den Verlust der LMP7-Expression zu reagieren als Endothelzellen anderer Organe. So zeigten nur Endothelzellen der Niere eine Zunahme der Zellgröße und – granularität und peritubuläre Endothelzellen wiesen verringerte Oberflächenlevel an MHC Klasse II-Molekülen auf, während in glomerulären Endothelzellen Immunglobulin G (IgG) akkumulierte. Weiterhin wies die glomeruläre Filtrationsbarriere (GFB) eine deutlich veränderte Ultrastruktur auf. Neben einem Verlust der glomerulären Fenestrierung, zeigte sich auch eine deutliche Fußfortsatzverschmelzung der Podozyten. Diese Beobachtungen standen in starkem Kontrast dazu, dass die Tiere keine erhöhte Albuminurie aufwiesen, einem klassischen Marker für eine beeinträchtigte GFB. Die erhöhte Granularität zusammen mit den veränderten Oberflächenlevel mehrerer Proteine und einer Veränderung im IgG-Handling deuten eine Beeinträchtigung des endozytischen Systems durch den Verlust von LMP7 an. Die Analyse des globalen Transkriptoms und Proteoms erlaubte die Identifikation möglicher Mechanismen für die beobachteten phänotypischen zellulären Veränderungen. MORF4L2 wurde dabei als mögliches Immunoproteasom-spezifisches Substrat identifiziert. Eine mögliche Rolle des endothelialen Immunoproteasoms in Krankheitsbildern wurde mithilfe des BTBR ob/ob-Modells der diabetischen Nephropathie (DN) und des NTN-Modells einer rasch progressiven Glomerulonephritis untersucht. Dabei zeigte sich, dass das (Immuno)Proteasom in der DN vor allem in Endothelzellen und Podozyten induziert war. Erhöhte Proteinlevel der katalytischen Untereinheiten spiegelten sich jedoch nicht in einer gesteigerten proteasomalen Aktivität wider, die im Gegenteil leicht reduziert war. Überraschenderweise konnte keine Akkumulation proteasomaler Substrate wie K48-polyubiquitinierter Proteine beobachtet werden. Mechanistische Untersuchungen im NTN-Modell in der LMP7ΔEnC – Mauslinie deuteten einen protektiven Effekt endothelialer LMP7-Expression in immunvermittelten glomerulären Erkrankungen an. So zeigten Knockout-Tiere einen aggravierten klinischen und morphologischen Krankheitsverlauf mit höherer Albuminurie, schlechteren Serumwerten und stärkerer Halbmondbildung in den Glomeruli. Sowohl glomeruläre Endothelzellen als auch Podozyten wiesen in der Abwesenheit von LMP7 stärkeren Schaden auf. Die vorliegende Arbeit betont die funktionale Relevanz der endothelialen Expression des Immunoproteasoms unter homöostatischen Bedingungen, nicht nur für die Endothelzellen selbst. Diese Daten zur organspezifischen Rolle und zur Involvierung des endothelialen Immunoproteasoms in pathologische Prozesse liefern vielversprechende Anhaltspunkte zur weiteren Untersuchung der für die beobachteten Veränderungen verantwortlichen Mechanismen.