Titel: | Insights into the vaccinia virus assembly mechanism provided by cellular electron cryo-tomography | Sonstige Titel: | Einblicke in den Assemblierungsmechanismus des Vacciniavirus durch zelluläre Kryoelektronentomographie | Sprache: | Englisch | Autor*in: | Feldmann, Clara Andrea | Schlagwörter: | in-cell structural biology; viral membrane; virion morphogenesis | GND-Schlagwörter: | PockenvirenGND KryoelektronentomografieGND Vaccinia-VirusGND StrukturbiologieGND CapsidGND CytologieGND |
Erscheinungsdatum: | 2025 | Tag der mündlichen Prüfung: | 2025-07-11 | Zusammenfassung: | Poxviruses are large, enveloped cytoplasmic dsDNA viruses with epidemic potential. Among them, vaccinia virus (VACV), historically used as a live vaccine to eradicate smallpox, serves as a well-established model for studying poxvirus biology. Unlike conventional viral membrane acquisition via budding or wrapping, poxvirus morphogenesis follows a unique mechanism: cellular membranes are recruited to the cytoplasmic viral assembly site, disrupted, and extensively remodeled into precursors with stabilized open ends. Binding of these membrane precursors to a viral scaffold protein induces a distinct curvature, forming the characteristic crescent-shaped intermediates. As these crescents expand, they encapsulate viral DNA and proteins, forming spherical, immature virions. These immature particles undergo dramatic structural remodeling during maturation, culminating in the formation of infectious virions with a complex internal core. Despite extensive studies, the molecular mechanisms underlying poxvirus assembly and maturation remain largely unknown. Here, I employed cellular electron cryo-tomography (cryoET) to investigate the stepwise VACV assembly in infected cells. Using correlative imaging and focused ion beam (FIB)-milling of plunge-frozen VACV-infected cells, I analyzed viral assembly sites by cryoET and captured individual viral particles in situ across all stages of morphogenesis. This approach enabled direct visualization of viral genome incorporation, a process that remains poorly understood. Additionally, I identified possible maturation intermediates, offering new insights into viral core formation. Focusing on the viral membrane, segmentation analysis revealed distinct features such as the size, shape, curvature, and continuity of membrane precursors and growing crescents. Finally, subvolume averaging provided novel insights into the structural organization and lattice arrangement of the viral scaffold protein responsible for inducing membrane curvature in crescents and immature virions. Pockenviren sind große, behüllte zytoplasmatische dsDNA-Viren mit epidemischem Potenzial. Vaccinia-Virus (VACV), einst als Lebendimpfstoff zur Ausrottung der Pocken eingesetzt, dient nun als etabliertes Modell zur Untersuchung der Pockenvirus-Biologie. Im Gegensatz zur klassischen Membranbildung durch Knospung oder Umhüllung erfolgt die Morphogenese dieser Viren über einen einzigartigen Mechanismus. Die Assemblierung von VACV findet in bestimmten, durch das Virus umorganisierten Bereichen des Zytoplasmas statt. Zelluläre Membranen werden dorthin rekrutiert, geöffnet und zu viralen Vorläufern mit stabilisierten, offenen Membranenden umstrukturiert. Bindung an das virale Gerüstprotein D13 induziert eine spezifische Membrankrümmung, wodurch die charakteristischen halbmondförmigen Membranstrukturen entstehen. Diese „Halbmonde“ wachsen weiter, um sich zu sphärischen, unreifen Viruspartikeln zu schließen. Dabei nehmen sie virale DNA und Proteine in sich auf. Während der anschließenden Reifung erfahren diese Partikel tiefgreifende strukturelle Veränderungen, darunter die Bildung einer komplexen internen Kernstruktur. Trotz intensiver Forschung sind die molekularen Mechanismen dieser Prozesse noch weitgehend ungeklärt. Um die schrittweise Assemblierung von VACV in infizierten Zellen zu untersuchen, setzte ich zelluläre Elektronen-kryo-Tomographie (cryoET) ein. Mithilfe korrelativer Bildgebung und FIB-Fräsung (Focused Ion Beam) von tiefgefrorenen VACV-infizierten Zellen gelang es mir, virale Assemblierungsregionen gezielt zu analysieren und individuelle Viruspartikel in situ in verschiedenen Entwicklungsstadien abzubilden. Dabei konnte ich virale Partikel während der Genominkorporierung beobachten – ein Prozess, der bislang wenig verstanden ist. Zudem identifizierte ich potenzielle Reifungsintermediate, die neue Einblicke in die Ausbildung der viralen Kernstruktur liefern. Virale Halbmondmembranen und ihre Vorläufer wurden mithilfe von Segmentierungen anhand ihrer Morphologie, lokalen Eigenschaften und Kontinuität untereinander charakterisiert. Durch die Prozessierung von Subvolumina, welche das virale Protein D13 enthalten, konnte ich eine gemittelte Struktur der Anordnung dieses Proteins im nativen viralen Gerüst auflösen. Diese bietet wichtige neue Einblicke in die strukturelle Organisation und Gitteranordnung, welche für die Krümmung der Membran in „Halbmonden“ und unreifen Virionen verantwortlich ist. |
URL: | https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/11821 | URN: | urn:nbn:de:gbv:18-ediss-130063 | Dokumenttyp: | Dissertation | Betreuer*in: | Grünewald, Kay Uetrecht, Charlotte |
Enthalten in den Sammlungen: | Elektronische Dissertationen und Habilitationen |
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Datei | Beschreibung | Prüfsumme | Größe | Format | |
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