Discovering the Potential of Microalgae-Bacterial Consortia for New Strategies in Fighting off Bacterial Biofilms

Abstract

Bacterial biofilms are comparable to organs complex structures that provide protection and nutrition to their inhabitants. The biofilm matrix shields embedded bacteria by trapping antibiotics, toxins and agents of the host immune system at the surface while inside the biofilm bacteria enhance their endurance through genetic exchange, physiological heterogeneity and metabolic reduction. Due to their highly resilient character, biofilms cause severe and costly problems in industry, farming and health care, with this study focusing particularly on challenges of the fast-growing sector of aquaculture. Facing the limited number of available antibiotics and in contrast the constantly growing antibiotic resistance in bacteria, new strategies are inevitable to address pathogenic bacteria and their sheltering surrounding. Microalgae are small, unicellular organisms that successfully inhabit all kinds of aquatic environments displaying a worldwide distribution. Their cooperative lifestyle with beneficial bacteria shelters their survival in challenging environments and protects them efficaciously from pathogenic threads. Up to date little is known about the composition and the intrinsic potential of these microalgae-bacterial consortia. Hence, the present study focused on the potential of microalgae-bacterial consortia to influence biofilm formation of pathogenic bacteria. This question was addressed by data mining of newly established metagenomes and by practical application. First approaches made use of the total supernatant of various microalgae cultures to find out if there is any effect on bacterial biofilms proved by static anti-biofilm assay and, as effects were measurable, which microalgae’s supernatant showed the highest inhibiting effect in terms of biofilm reduction. Of 17 marine and freshwater microalgae cultures (data not entirely shown) the six candidates with the highest inhibitory results on bacterial biofilms of Pseudomonas aeruginosa PA14, Burkholderia cenocepatia K56-2, Stenotrophomonas maltophilia K279a, Stenotrophomonas maltophilia SM454 and Klebsiella pneumonie WT1617 were chosen for further investigation. The supernatant of the marine microalgae Tetraselmis chui reduced biofilm in all tested bacteria significantly by an average of 57.2%. Biofilm inhibition, if only for certain bacterial species each, was also observed for the supernatants of the marine microalgae Nannochloropsis salina, Isochrysis galbana and Isochrysis spec. as well as for the freshwater microalgae Chlorella vulgaris, and Scenedesmus acuminatus. The inhibitory potential of the total supernatants of microalgae cultures on the biofilm of P. aeruginosa PA14 was explored more deeply by laser scanning confocal microscopy (LSCM). Calculations of total cell numbers within a defined biofilm area revealed a decrease of 25% of P. aeruginosa cells after treatment with T. chui supernatant and alterations in biofilm architecture towards lower biofilm density. Metagenomes of the six effective microalgae were prepared to first enlighten the phylogeny of the bacterial communities encompassing the individual microalgae and second to elucidate their enzymatic potential. Though all of the microalgae-bacterial consortia showed a prevalent fraction of proteobacteria with an emphasis on alphaproteobacteria, particularly apparent in T. chui, I. galbana and C. vulgaris, the composition of the consortia on genus level occurred highly divers. Only the marine bacteria Roseobacter, Roseovarius, Muricauda and Marinobacter appeared repeatedly within the metagenomes. Promising enzyme classes were explored and quantified for current and future use. Since bacterial biofilms promote virulence and decrease antibiotic susceptibility a multifaceted approach seems to be required to either alter the biofilm architecture for better access of classic antibiotics to the embedded pathogens or to weaken and ideally inhibit the process of biofilm formation. Hence, the metagenome data of the six microalgae-bacterial consortia should serve as a valuable toolbox for advances to interfere with key points in biofilm formation such as quorum sensing, initial attachment or accumulation of EPS (extracellular polymeric substances) with special regard to the role of extracellular DNA. First experiences with a microalgae-metagenome-derived enzyme were gained with a putative quorum quenching dienelactone hydrolase (Dlh3). Due to its intended application in aquaculture, Dlh3 was administered to the fish pathogens Edwardsiella anguillarum, Aeromonas salmonicida, P. aeruginosa, Flavobacterium columnare and Flavobacterium psychrophilum. Interactions of Dlh3 and the fish pathogens were analyzed in static anti-biofilm assays, LSCM, and oCelloScope, revealing decreased biofilm formation, e.g., for E. anguillarum of up to 54.4% in static anti-biofilm assay and alterations in biofilm construction in optical approaches. Encouraged by these impressions more target-specific enzymes were chosen from the newly prepared metagenome data of microalgae-bacterial consortia. The successfully overexpressed enzymes, a methylcytosine-specific restriction endonuclease, that cleaves DNA in a specific, modified context, an 8-oxoguanine deaminase, that alters external DNA and a second dienelactone hydrolase were characterized by phylogenetic and structural attributes. First applications of the enzymes on fish pathogens, analyzed by LSCM, had considerable effects on the viability and structure of the observed biofilms. Considering the harmlessness of the enzymes stated in toxicity assays, this study might be a path-breaking approach for a versatile attack on pathogenic biofilms to avoid bacterial adaptation and resistance to antibiotic treatment and simultaneously, by harboring a wide-range enzymatic toolbox, maintaining the flexibility to react to changing demands e.g. in the context of high-density farming as for aquaculture.

Bakterielle Biofilme weisen vergleichbar mit Organen komplexe Strukturen auf, die den innewohnenden Bakterien Schutz und Nahrung gewähren. Die Biofilm Matrix schützt die Bakterien im Biofilm indem sie Antibiotika und Angriffe des Wirts‘ eigenen Immunsystems abfängt, während die Bakterien im Biofilm ihre Lebensfähigkeit durch genetischen Austausch, physiologische Heterogenität und Reduzierung des metabolischen Umsatzes steigern. Durch ihren starken protektiven Charakter verursachen Biofilme große Schäden und hohe Kosten in Industrie, Tierzucht und im Gesundheitswesen. Ein besonderes Augenmerk legt diese Studie auf die Herausforderungen im schnell wachsenden Sektor der Aquakultur. Im Bewusstsein der begrenzten Verfügbarkeit von und der stetig wachsenden Resistenz gegen die angewandten Antibiotika, ist es unerlässlich, neue Strategien gegen krankheitserregende Bakterien und ihre schützende Umgebung zu entwickeln. Mikroalgen sind kleine, einzellige Organismen, die mit ihrer weltweiten Ausbreitung erfolgreich alle Arten von aquatischen Lebensräumen bewohnen. Die Kooperation mit Bakterien sichert ihr Überleben in herausfordernden Lebensräumen und schützt sie weitgehend vor Pathogenen. Über die Zusammensetzung der Mikroalgen-Bakterien-Gemeinschaften ist bisher wenig bekannt. Diese Studie untersucht daher eingehend das Potential von Mikroalgen-Bakterien-Gemeinschaften, Einfluss auf die Bildung von Biofilmen pathogener Bakterien zu nehmen. Dafür wurden Daten von neu etablierten Mikroalgen-Metagenomen analysiert und verschiedene praktische Anwendungen erprobt. Zunächst wurde der komplette Überstand von Mikroalgenkulturen genutzt um festzustellen, ob ein Effekt auf die Biofilmbildung pathogener Bakterien in einem statischen Anti-Biofilm-Assay messbar wäre, und welche Mikroalgenkulturen die stärkste biofilmreduzierende Wirkung erzielten. Von 17 getesteten marinen und Süßwasser Mikroalgenkulturen (Daten nicht vollständig dargestellt) wurden die sechs Kulturen mit der stärksten inhibitorischen Wirkung auf die Biofilme der Bakterien Pseudomonas aeruginosa PA14, Burkholderia cenocepatia K56-2, Stenotrophomonas maltophilia K279a, S. maltophilia SM454 und Klebsiella pneumonie WT1617 für weitere Untersuchungen ausgewählt. Der Überstand der Mikroalge Tetraselmis chui, zeigte eine biofilmreduzierende Wirkung auf alle getesteten Bakterien mit einer durchschnittlichen Verminderung um 57.2%. Biofilminhibition, wenn auch jeweils nur für einzelne Pathogene, zeigten darüber hinaus die marinen Mikroalgen Nannochloropsis salina, Isochrysis galbana und Isochrysis spec. sowie die Süßwasser Mikroalgen Chlorella vulgaris und Scenedesmus acuminatus. Das inhibitorische Potential der kompletten Überstände von Mikroalgenkulturen auf den Biofilm von P. aeruginosa PA14 wurde tiefergehend mittels Laser scanning confocal microscopy (LSCM) ermittelt. Eine 25%ige Reduktion der absoluten Zellzahlen innerhalb eines definierten Bereichs eines P. aeruginosa Biofilms konnte nach Zugabe des Überstands der Mikroalge T. chui berechnet werden. Gleichzeitig veränderte sich die Architektur des P. aeruginosa Biofilms in Richtung einer geringeren Dichte. Von den sechs wirkungsvollen Mikroalgen wurden Metagenome angefertigt, um die Phylogenie der kooperierenden Bakterien zu ergründen, sowie Einblicke in das enzymatische Potential der Mikroalgen-Bakterien-Gemeinschaften zu gewinnen. Trotzdem sich in allen Metagenomen ein hoher Anteil an Proteobakterien, vor allem Alpha Proteobakterien zeigte, insbesondere bei T. chui, I. galbana und C. vulgaris, herrschte auf Genus-Level hohe Diversität. Einzig die marinen Bakterien Roseobacter, Roseovarius, Muricauda and Marinobacter waren in mehreren Metagenomen nachweisbar. Des Weiteren wurden mögliche wirkungsvolle Enzyme in den Metagenomdaten für aktuelle und zukünftige Anwendungen klassifiziert und quantifiziert. Da Biofilme bakterielle Virulenz verstärken und die Empfindlichkeit gegenüber antibakteriellen Substanzen verringern scheint nur ein breitgefächerter Ansatz erfolgsversprechend, um entweder die Biofilmarchitektur aufzubrechen und klassischen Antibiotika den Zugang zu den Bakterien zu erleichtern oder um den Prozess der Biofilmformation zu schwächen, im besten Falle sogar zu unterbinden. Die Metagenomdaten sollten daher als Werkzeugkasten dienen, Schlüsselstellen in der Biofilmbildung wie das Quorum Sensing, die initiale Anheftung oder die Anreicherung von EPS (extracellular polymeric substances) anzugreifen. Ein besonderes Augenmerk sollte auf die Rolle der extrazellulären DNA gerichtet werden. Erste Erfahrungen mit einem Enzym, das auf Grundlage eines Mikroalgenmetagenoms entwickelt wurde, konnten mit einer Dienlacton Hydrolase (Dlh3) gewonnen werden, die wahrscheinlich im Sinne des Quorum Quenchings wirkt. Im Hinblick auf deren Anwendbarkeit im Aquakultur-Sektor wurde Dlh3 an den Fischpathogenen Edwardsiella anguillarum, Aeromonas salmonicida, P. aeruginosa, Flavobacterium columnare und Flavobacterium psychrophilum erprobt. Die Wirkung der Dlh3 auf die Fischpathogene wurde in statischen Anti-Biofilm-Assays, LSCM und dem oCelloScope getestet. Um bis zu 54.4% konnte die Biofilmbildung z.B. in E. anguillarum reduziert werden, einhergehend mit Veränderungen der Biofilmarchitektur, die in den optischen Verfahren deutlich wurden. Ermutigt durch die gewonnenen Erkenntnisse, wurden weitere zielgerichtete Enzyme in den neu etablierten Metagenomdaten der Mikroalgen-Bakterien-Gemeinschaften gesucht. Die erfolgreich überexprimierten Enzyme, eine Methylcytosin-spezifische Restriktionsendonuclease, die DNA an spezifisch modifizierten Basen schneidet, eine 8-Oxoguanin Deaminase, die extrazelluläre DNA modifiziert und eine zweite Dienlacton Hydrolase wurden phylogenetisch und strukturell charakterisiert. Erste Anwendungen der Enzyme auf Fischpathogenen zeigten deutliche Effekte auf die Überlebensfähigkeit der bakteriellen Zellen im Biofilm und auf die Strukturen der Biofilme im LSCM. In Anbetracht der Unschädlichkeit der untersuchten Enzyme für eukaryotische Zellen, die in Toxizitätstests bewiesen wurde, könnte diese Studie ein wegweisender Ansatz für einen vielfältigen Angriff auf bakterielle Biofilme sein, der die Gefahr der Resistenz vermindert und gleichzeitig, durch den Charakter eines variablen Werkzeugkastens die Flexibilität erhält, auf wechselnde Bedürfnisse zu reagieren, wie sie in Tierzucht mit hoher Dichte, wie der Aquakultur, zu erwarten sind.