Die Rolle einer aberranten Osteoklastogenese in der Entwicklung von Osteosklerose in Myeloproliferativen Neoplasien

Abstract

Die genauen zugrundeliegenden Mechanismen einer aberranten Osteoklastogenese auf Basis klonaler Malignität einer hämatopoetischen Stammzelle in MPN sind bisher nur unzureichend verstanden. Da Osteoklasten aus der Fusion monozytischer Progenitoren entstehen und eine allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation zu einer raschen Regression der Osteosklerose führt, wurde eine aufwendige Osteoklastenkultur aus humanen CD34+CD133+ Stammzellen von gesunden KM-Spendern (n=14) sowie Patientenblut (n=21) zur Untersuchung der Osteoskleroseentstehung entwickelt. Die bereits in der Kultivierungszeit auffallende längere Differenzierungszeit in den Patientenkulturen wurde durch spätere FACS-Analysen bestätigt: Stammzellen von Patienten ließen sich in deutlich reduziertem Maße zu TRAP+ Prä- (1-4 Nuclei) und Osteoklasten (>6 Nuclei) differenzieren (p<0,0001 und p=0,0276) und exprimierten darüber hinaus weniger RANK (p=0,02) und αvβ₃ (p=0,0128), was erste Hinweise für eine kompromittierte Knochenresorption repräsentierte. Ein gestörte Knochenhomöostase zu Ungunsten einer Resorption konnte durch die Zellkultivierung auf dem Knochenäquivalent Dentin nachgewiesen werden (p=0,0003) werden. Interessanterweise zeigten genau jene Zellen, welche in Kultur „Knochennähe“ suchten, keine Mutationen auf und ließen sich damit deutlich von den mutationstragenden und funktionslosen Zellen unterscheiden (p=0,0156). Ebenso differenzierte sich im Rahmen eines Phagozytose-Assays zur Beleuchtung der Monopoese die Stammzellfraktion von Patienten in erheblich geringerem Maße zu HLA-DR+ Zellen, welche Phagozytose betrieben und damit funktionstüchtig waren (p=0,0023) sowie nur eine Minderheit exprimierte die Monozyten-/Makrophagen-spezifischen Oberflächenmarker CD14 und CD16 (0,0047). Diese Erkenntnisse wurden in Colony-Assays durch ein vermindertes klonogenes Potential der Patientenzellen nach sieben Tagen Zellkultur bestätigt (p=0,03). Auch wenn die geschilderten Ergebnisse deutliche Unterschiede zwischen der gesunden und Patientenkohorte hinsichtlich einer gestörten Mono-/ Osteokalstogenese präsentieren, stellen die kleinen Fallzahlen (auf Basis der Erkrankungsgruppenrarität) jedoch die größte Limitation dieser Arbeit dar. Dennoch konnte durch die Etablierung einer stabilen Osteoklastenkultur aus humanen Stammzellen über mehrere Wochen ein Beitrag für ein besseres Verständnis dieser seltenen sowie bis heute nur unzureichend verstandenen Erkrankungsgruppe geleistet und das übergeordnete Ziel, die Pathologie der Osteoklasto-genese aufzuzeigen und mögliche Erklärungsansätze der Osteoskleroseentstehung dar-zulegen, erreicht werden. Darüber hinaus stellt nicht nur das Kultursystem eine Neuheit dar, sondern auch die Entwicklung verschiedener Funktionsassays zur Analyse dieser multi-nukleären Zellen, welche auch in anderen Forschungsgebieten zum Tragen kommen kann.

The exact underlying mechanisms contributing to an aberrant osteoclastogenesis in Myeloproliferative neoplasms (MPN), based on the clonal malignancy of a hematopoietic stem cell, are still deficiently understood. Since osteoclasts arise from the fusion of monocytic progenitors and allogenic hematopoietic stem cell transplantation leads to a rapid regression of osteosclerosis, an elaborate osteoclast culture from human CD34+CD133+ stem cells of healthy bone marrow donors (n=14) and patient blood (n=21) was carried out to investigate osteosclerosis development. Already during the cultivation period of the two cohorts, a longer differentiation time until multinucleated cells developed, was observed in the patient cultures and confirmed by later flow cytometric findings: Stem cells from patients differentiated to a significantly reduced extent into TRAP+ pre- (1-4 nuclei) and osteoclasts (>6 nuclei) (p<0.0001 and p=0.0276) and also expressed less RANK (p=0.02) and αvβ₃ (p=0.0128), representing initial evidence of compromised bone resorption. A disturbed bone homeostasis to the detriment of resorption could be demonstrated by cell cultivation on the bone equivalent dentin (p=0.0003). Interestingly, precisely those cells that sought “bone proximity” in culture showed no mutations and could thus be clearly distinguished from the mutation-bearing and functionless cells (p=0.0156). Similarly, in a phagocytosis assay for monopoietic cells, the hematopoietic stem cell fraction of patients differentiated significantly less into HLA-DR positive cells that underwent phagocytosis and were thus functional (p=0.0023) and only a minority expressed the monocyte/macrophage-specific surface markers CD14 and CD16 (0.0047). These findings were confirmed in colony assays by a reduced clonogenic potential of the patient cells after seven days of cell culture (p=0.03). Even though the results described show clear differences between healthy bone marrow and patient cohorts with regard to impaired mono-/ osteoclastogenesis, the small number of cases (given the rarity of the various MPN entities) represents the greatest limitation of this work. Nevertheless, the establishment of a stable OSC culture from fresh human stem cells over a period of several weeks has contributed to a better understanding of this rare and still insufficiently understood group of diseases and has achieved the overarching goal of elucidating the pathology of osteoclastogenesis and providing possible explanations for the development of osteosclerosis. Furthermore, not only the culture system, but also the development of various functional assays for the analysis of these multinucleated cells represents a novelty, which can also be used in other research areas.