Transcriptional regulation of male meiosis by the DREAM complex in Arabidopsis thaliana

Abstract

Meiosis ensures genomic stability and diversity in sexual reproduction, requiring precise gene expression regulation. Despite its importance, control of the plant meiotic transcriptome remains poorly understood due to technical challenges. This study investigates the DREAM complex as a transcriptional regulator of male meiosis in Arabidopsis thaliana. Originally described as a transcriptional repressor of cell cycle genes in quiescent animal cells, the DREAM complex is now known to have a broader role and has been described to also influence reproductive development in C. elegans, D. melanogaster, and mice. So far, the Arabidopsis DREAM complex has been associated with cell cycle regulation, DNA damage response, and DNA methylation maintenance in somatic context. In my thesis, I focused on the putative DNA-binding subunits TCX and ALY, which localize to chromosomes during meiosis. The double mutants aly1/2 and tcx5/6 exhibits reduced seed and pollen viability, increased pollen size variability, and meiotic defects including impaired pairing, synapsis, and crossover formation, leading to unbalanced chromosome segregation. To elucidate the origin of these defects, the transcriptomes of wildtype and mutant male meiocytes are compared, which reveals differential regulation of genes involved in cross over (CO) formation, double strand break (DSB) repair, and chromosome organization. Notably, anti-CO factors are upregulated, while the Class I CO pathway member MER3 is downregulated. CUT&Tag assays shows that TCX5 binds the MER3 promoter, and MER3 overexpression partially rescues recombination defects in DREAM mutants, indicating that the DREAM transcriptionally regulates meiotic recombination to some extend via MER3 transcriptional activation. Furthermore, DREAM mutants display increased reliance on alternative DSB repair pathways. Combinations with mus81 and anti-CO mutants show that DREAM is essential for effective DSB repair and genome integrity. Live-cell imaging of DREAM mutants revealed delayed and asynchronous meiotic progression and disrupted microtubule architecture in tcx5/6. Testing DREAM associated components for involvement in meiosis, I found that MYB3R3 localizes to meiotic chromosomes and that repressive MYB3Rs are required for proper chromosome segregation in meiosis II. Finally, altered DNA methylation patterns in DREAM mutants suggest that hypermethylation contributes to meiotic defects. Combining DNA methylation mutants with aly1/2 or tcx5/6 partially rescues these defects, highlighting methylation as an additional layer in DREAM-mediated regulation during meiosis. Collectively, these findings establish the plant DREAM complex as a key regulator of meiotic gene expression, indispensable for meiotic recombination, DSB repair, and progression through meiosis.

Die Meiose gewährleistet genomische Stabilität und Vielfalt im Rahmen der sexuellen Fortpflanzung und erfordert eine präzise Regulation der Genexpression. Die Kontrolle des meiotischen Transkriptoms von Pflanzen ist aufgrund technischer Heraus- forderungen noch weitgehend unverstanden. Diese Studie untersucht den DREAM- Komplex als transkriptionellen Regulator der männlichen Meiose in Arabidopsis thaliana. Ursprünglich wurde der DREAM-Komplex als transkriptioneller Repressor von Zellzyklusgenen in ruhenden tierischen Zellen beschrieben. Inzwischen ist bekannt, dass er eine breitere Rolle spielt und auch die reproduktive Entwicklung in C. elegans, D. melanogaster und Mäusen beeinflusst. Ein homologer Komplex in Arabidopsis ist an der Zellzyklusregulation, der DNA-Schadensreaktion und der Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung im somatischen Kontext beteiligt. In meiner Arbeit habe ich vor allem die mutmaßlich DNA-bindenden Untereinheiten TCX und ALY untersucht, die während der Meiose an den Chromosomen lokalisiert sind. Die Doppelmutanten aly1/2 und tcx5/6 zeigten eine verminderte Anzahl lebender Samen und Pollen, eine erhöhte Variabilität der Pollengröße sowie Defekte in der Meiose, z.B. gestörte Chromosomenpaarung, - synapsis und Crossover-Bildung, was zu einer unausgewogenen Chromosomensegregation führte. Um der Ursache dieser Defekte auf die Spur zu kommen, habe ich die Transkriptome von wildtypischen und mutierten männlichen Meiozyten verglichen und eine unterschiedliche Regulation von Genen beobachtet, die an der Bildung von Crossovern (CO), der Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB) und der Chromosomenorganisation beteiligt sind. Während Anti-CO-Faktoren hochreguliert waren, war MER3, eine Komponente des Klasse-I-CO-Weges, herunterreguliert. CUT&Tag-Assays zeigten, dass TCX5 an den MER3-Promotor bindet und eine Überexpression von MER3 rettete zum Teil die Rekombinationsdefekte der DREAM-Mutanten, was darauf hindeutet, dass der DREAM Komplex die meiotische Rekombination unter anderem über die Transkriptionsaktivierung von MER3 reguliert. Darüber hinaus wiesen DREAM-Mutanten eine erhöhte Abhängigkeit von alternativen DSB-Reparaturwegen auf. Die Kombination mit mus81- und Anti-CO- Mutanten zeigte, dass der DREAM für eine effektive DSB-Reparatur und die Genomintegrität essenziell ist. Lebendzellbeobachtungen von DREAM-Mutanten ergaben eine verzögerte, asynchrone Meiose und eine gestörte Mikrotubuli-Dynamik in tcx5/6. Im Rahmen der Untersuchung von DREAM-assoziierten Komponenten auf ihre Beteiligung an der Meiose stellte ich fest, dass MYB3R3 an meiotische Chromosomen lokalisiert ist und dass repressive MYB3Rs für eine ordnungsgemäße Chromosomentrennung in der Meiose II erforderlich sind. Schließlich deuteten veränderte DNA-Methylierungsmuster in den DREAM- Mutanten darauf hin, dass Hypermethylierung zu den Meiose-Defekten beiträgt. Die Kombination von DNA-Methylierungsmutanten mit aly1/2 oder tcx5/6 rettete diese Defekte teilweise, was Methylierung als eine weitere regulatorische Ebene in der DREAM-vermittelten Regulation während der Meiose identifiziert. Insgesamt belegen diese Ergebnisse, dass der pflanzliche DREAM-Komplex einen wichtigen Regulator der meiotischen Genexpression darstellt, der für die meiotische Rekombination, die DSB-Reparatur und den Fortschritt der Meiose unverzichtbar ist.