Netzwerkanalyse neuartiger Glycosyltransferasen aus dem Phylum Bacteroidota

Abstract

Glycosyltransferasen sind die entscheidenden Biokatalysatoren der enzymatischen Glykosylierung. Dieser Prozess ist einer von zahlreichen biologischen Modifizierungsvorgängen an Zellen, genetischem Material oder wie im Falle der Glykosylierung an Molekülen, die überall auf der Welt zu finden sind. Beim Modifizierungsprozess der Glykosylierung, werden Kohlenhydratstrukturen an Proteine, Lipide oder andere Moleküle übertragen. Die Glykosylierung kann sowohl durch Enzyme katalysiert werden als auch ohne den Einfluss von Enzymen erfolgen. Dies wird dann als Glykation bezeichnet. Die enzymatische Glykosylierung wird durch Enzyme, die zu der Klasse der Transferasen zählen, genauer den Glycosyltransferasen katalysiert. Diese Enzyme übertragen aktivierte Zuckermoleküle, sogenannte Nukleotidzucker, auf verschiedenste Akzeptormoleküle. Der Modifikationsprozess verändert die Struktur und Funktion des jeweiligen Moleküls, wodurch sich Eigenschaften wie Stabilität oder Bioverfügbarkeit ändern können. Beispielhaft können hier Polyphenole genannt werden, die mit einer Vielzahl von vorteilhaften Eigenschaften, wie entzündungshemmend oder krebsvorbeugend in Verbindung gebracht werden, aber auf Grund ihrer schlechten Wasserlöslichkeit eine geringe Bioverfügbarkeit aufweisen. Diese Verfügbarkeit kann durch den Modifizierungsprozess der Glykosylierung erhöht werden. Diese Arbeit befasste sich gezielt mit der Identifizierung und Charakterisierung neuartiger Glycosyltransferasen. Besonderer Fokus lag dabei auf der Erschließung neuer, dem Phylum Bacteroidota zuzuordnenden Glycosyltransferasen. Als Ausgangspunkt diente ein auf Grundlage von Sequenzen bereits beschriebener Glycosyltransferasen moduliertes Hidden Markov Model (Tabelle 25). Mit diesem Model wurden Datenbanken durchsucht, woraus mehr als 100 potenzielle Treffer für Glycosyltransferasen codierenden Genen resultierten. Eine Auswahl an 15 vielversprechenden Datenbankeinträgen, basierend auf Phylums-Zugehörigkeit, Sequenzlänge und/oder Verwandtschaft zu bereits bekannten GTs, wurden für genauere Untersuchungen ausgewählt. Von diesen konnte schließlich bei 6 Glycosyltransferasen (GT-HH01 – GT-HH06) glykosidische Aktivität nachgewiesen werden. Anschließend wurde auch das Substratspektrum, sowie die Expressionsfähigkeit für zukünftige in vitro Assays untersucht. Alle neu identifizierten Transferasen waren in der Lage die Flavonoide Quercetin und Naringenin zu glykosylieren. Besonders auffällig ist, dass die Glycosyltransferasen GT-HH01, GT-HH02 und GT-HH03 auch das Stilbenoid Oxyresveratrol glykosylieren können. Neben den experimentellen Untersuchungen, erfolgten auch eine in-silico Analyse der neuen Enzyme. Dabei wurde unteranderem der Faltungstyp der neuen Glycosyltransferasen moduliert, als auch erstmalig ein Interaktionsnetzwerk aller charakterisierten GTs erstellt. Alle sechs neuen Glycosyltransferasen weisen den Faltungstyp B auf, welcher aus zwei beta-alpha-beta Faltblättern besteht. Des Weiteren geht aus dem Interaktionsnetzwerk hervor, dass sich fast alle beschriebenen GTs in drei große Cluster unterteilen lassen. Die meisten der bekannten Glycosyltransferasen stammen aus den Phyla Pseudomonadota und Actinobacteria. Daneben stellte sich heraus, dass sich durch die Fokussierung auf das Phylum Bacteroidota in dieser Arbeit, die Anzahl der aus diesem Phylum bekannten Glycosyltransferasen nahezu verdoppelt werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen das enorme Potenzial des Phylums Bacteroidota in Bezug auf die Identifizierung und Erschließung neuartiger Glycosyltransferasen, sowie der daraus resultierenden potenziellen zukünftigen Anwendung in der Biotechnologie.

Glycosyltransferases are the key biocatalysts of enzymatic glycosylation. This process is one of numerous biological modification processes on cells, genetic material or, as in the case of glycosylation, molecules that can be found all over the world. At the glycosylation modification process, carbohydrate structures are transferred to proteins, lipids or other molecules. Glycosylation can be catalyzed by enzymes as well as without the influence of enzymes. This is then referred to as glycation. Enzymatic glycosylation is catalyzed by enzymes belonging to the class of transferases, more precisely glycosyltransferases. These enzymes transfer activated sugar molecules, so-called nucleotide sugars, to various acceptor molecules. The modification process changes the structure and function of the respective molecule, which can alter properties such as stability or bioavailability. Examples include polyphenols, which are associated with a variety of beneficial properties such as anti-inflammatory or cancer-preventing but have low bioavailability due to their poor water solubility. This availability can be increased by the modification process of glycosylation. This work was specifically concerned with the identification and characterization of novel glycosyltransferases. Special focus was placed on the identification of new glycosyltransferases belonging to the phylum Bacteroidota. A Hidden Markov Model (Table 25) was modulated on the basis of sequences of already described glycosyltransferases served as a starting point. This model was used to search in various databases and results in more than 100 potential hits for genes encoding glycosyltransferases. A selection of 15 promising database entries, based on phylum affiliation, sequence length and/or relationship to already known GTs, were selected for further investigation. Of these, 6 glycosyltransferases (GT-HH01 - GT-HH06) were found to have glycosidic activity. Subsequently, the substrate spectrum as well as the expression capacity for future in vitro assays were investigated. All newly identified transferases were able to glycosylate the flavonoids quercetin and naringenin. It is particularly striking that the glycosyltransferases GT-HH01, GT-HH02 and GT-HH03 can also glycosylate the stilbenoid oxyresveratrol. In addition to the experimental studies, the new enzymes were also analyzed in silico. Among other things, the folding type of the new glycosyltransferases was modulated, and an interaction network of all characterized GTs was created for the first time. All six new glycosyltransferases show the folding type B, which consists of two beta-alpha-beta leaflets. Furthermore, the interaction network shows that nearly all described GTs can be divided into three large clusters. Most of the known glycosyltransferases originate from the phyla Pseudomonadota and Actinobacteria. In addition, it turned out that by focusing on the phylum Bacteroidota in this work, the number of glycosyltransferases known from this phylum could be almost doubled. These results show the enormous potential of the phylum Bacteroidota with regard to the identification and development of novel glycosyltransferases, as well as the resulting potential future application in biotechnology.