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Titel: Biochemische Charakterisierung und bioinformatische Sequenzanalyse plasmamembrangebundener Peroxidasen aus Maiswurzeln (Zea mays L.)
Sonstige Titel: Biochemical characterization and sequence analysis of plasma membrane-bound peroxidases isolated from corn roots (Zea mays L.)
Sprache: Deutsch
Autor*in: Mika, Angela
Schlagwörter: Biochemische Charakterisierung; Rboh; peroxidase; plasma membrane; membrane-bound; sequence analysis; biochemical characterization
GND-Schlagwörter: Peroxidase; Plasmamembran; Membranproteine; Sequenzanalyse <Chemie>
Erscheinungsdatum: 2005
Tag der mündlichen Prüfung: 2005-12-09
Zusammenfassung: 
In den letzten beiden Jahrzehnten gab es mehrfach Hinweise für die Existenz einer plasmamembrangebundenen Peroxidaseaktivität in pflanzlichen Zellen. Für diese membrangebundene Enzymaktivität wurde unter anderem eine Beteiligung an der Produktion von aktiven Sauerstoffverbindungen (Active oxygen species, AOS) sowie eine Entgiftung von AOS zum Schutz der Membran im Zusammenhang mit Pathogenabwehr und Zellwandaufbau diskutiert. Allerdings konnten Verunreinigungen durch lösliche apoplastische oder cytosolische Proteine für diese Untersuchungen nicht ausgeschlossen werden. Inzwischen wurde jedoch der Nachweis für die Existenz von fest an die Membran gebundenen Peroxidaseaktivitäten erbracht (Mika, 2001). In der vorliegenden Arbeit wurden diese membrangebundenen Peroxidaseaktivitäten aus Plasmamembranen von Maiswurzeln (Zea mays L.) partiell gereinigt und erstmals biochemisch charakterisiert. Die Sequenzen der zugehörigen Enzyme wurden identifiziert und bioinformatisch analysiert.

Es konnten vier verschiedene plasmamembrangebundene Peroxidasen (pmPOX1, pmPOX2a, pmPOX2b und pmPOX3) nachgewiesen werden. Als prosthetische Gruppen der Proteine wurden nichtkovalent gebundene Hämgruppen identifiziert. Die nativen molekularen Massen der Enzyme wurden durch Gelfiltration im Vergleich mit Standardproteinen ermittelt. Analysen der partiell gereinigten Proteine durch eine modifizierte nicht-reduzierende SDS-PAGE in Kombination mit einer Hämfärbung bestätigten die aus der chromatographischen Reinigung abgeleiteten Massen (138, 98, 57 und 55 kDa). Eine Glykosylierung der Proteine konnte durch verschiedene Methoden gezeigt werden. Als isoelektrische Punkte traten sowohl anionische als auch neutrale und kationische Werte auf.

Die partiell gereinigten Peroxidaseaktivitäten zeigten die für diese Enzyme charakteristische breite Substratspezifität. Da die Enzymaktivitäten in Gegenwart von 4-Hydroxyquecksilber-benzoesäure unverändert blieben und die Enzyme hohe Affinitäten zu phenolischen Substraten zeigten, ließen sich die untersuchten pmPOX entsprechend der Klassifizierung nach Welinder (1992) in die Klasse III der Superfamilie von Peroxidasen aus Pflanzen, Bakterien und Pilzen einordnen.
Für viele peroxidasevermittelte Funktionen ist die Bildung von AOS essentiell. Im Zusammenhang mit verschiedenen Stressfaktoren werden im wesentlichen zwei mögliche Quellen für die massive Produktion von AOS (oxidativen Burst) diskutiert: 1) Apoplastische Peroxidasen und 2) eine diphenylenjodoniumsensitive NAD(P)H-Oxidase (Respiratory burst oxidase homolog, Rboh). Um zu klären, ob und unter welchen Bedingungen die plasmamembrangebundenen Peroxidasen in vitro AOS produzieren können, wurden deren NAD(P)H-Oxidaseaktivitäten detailliert untersucht. So waren pmPOX1, pmPOX2a und pmPOX2b in vitro in der Lage, große Mengen an AOS zu produzieren. Einige Charakteristika dieser Aktivitäten, insbesondere ein pH-Optimum im sauren pH-Bereich sowie eine fehlende Stimulierbarkeit durch Calcium zeigten jedoch deutliche Unterschiede zu den bisher für eine Beteiligung von Peroxidasen am oxidativen Burst postulierten Eigenschaften.

Durch massenspektrometrische Analysen der Proteine und in silico Cloning konnten die full length Nukleinsäuresequenzen von pmPOX1 und pmPOX2b identifiziert und drei mögliche Sequenzen für pmPOX3 ermittelt werden. In einer bioinformatischen Analyse dieser Sequenzen konnten zahlreiche weitere Charakteristika der Enzyme abgeleitet und mit den experimentell ermittelten Daten verglichen werden. So wurden auf der Basis genomischer Nukleinsäuresequenzen der pmPOX strukturelle Aspekte der korrespondierenden Gene abgeleitet.
Alle Sequenzen der pmPOX zeigten auf Aminosäureebene die größten Sequenzübereinstimmungen zu Peroxidasen der Klasse III und deren klassische Charakteristika: Neben konservierten Peroxidasedomänen konnten unter anderem entsprechende putative Disulfidbrücken, Calciumbindestellen, Glykosylierungsstellen und zum ER-dirigierende N-terminale Signalpeptide identifiziert werden. Die dreidimensionale Struktur von pmPOX1 und pmPOX2b konnte anhand ähnlicher, löslicher Klasse-III-Peroxidasen modelliert werden. Bioinformatische Voraussagen hydrophober Domänen im Vergleich mit Solubilisierungsexperimenten deuten darauf hin, dass das zum ER-dirigierende Signalpeptid jeweils nicht abgespalten und die Proteine durch eine N-terminale transmembrane Domäne verankert werden.

Homologe Proteine der plasmamembrangebundenen Peroxidasen konnten in verschiedenen monokotylen und dikotylen Pflanzenarten ermittelt sowie die einzelnen pmPOX in die von Passardi et al. (2004) aufgestellten Untergruppen für sekretorische Peroxidasen eingeordnet werden. Eine in silico Northern-Blot-Analyse deutet darauf hin, dass sowohl pmPOX1 als auch pmPOX2b hauptsächlich in Wurzelgeweben exprimiert werden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden mögliche Funktionen der plasmamembrangebundenen Enzyme diskutiert.

In the last decades several investigations indicated the presence of a plasma membrane-bound peroxidase activity in plant cells. For these enzymes located directly at the membrane several functions were postulated including protection of the membrane or production of active oxygen species (AOS) in pathogen defense or cell wall formation. This study is the first to purify and characterize the responsible enzymes from highly enriched and thoroughly washed plasma membranes. The sequences of the corresponding enzymes were identified and analyzed.

Four different obviously tightly plasma membrane-bound peroxidases (pmPOX) could be partially purified (138, 98, 57, and 55 kDa in non-reducing SDS-PAGE). Non-covalent bound heme groups were identified as prosthetic groups. The glycosylation of the proteins could be shown by different methods. The determination of isoelectric points showed anionic as well as neutral and cationic values.

The H2O2-detoxifying activities of the partially purified pmPOXs showed distinct properties in dependence on substrates and effectors. Since the enzymes were localized at the plasma membrane, not effected by p-chloromercuribenzoate, and showed high affinities to phenolic compounds, they could be categorized as class III peroxidases of the superfamily of peroxidases from plants, fungi and bacteria according to Welinder et al. (1992).

Besides H2O2-detoxification the formation of AOS is essential for many peroxidase-dependent functions. So far two main sources for the massive production of AOS, the so-called oxidative burst, in presence of several abiotic or biotic stress factors have been discussed: 1) apoplastic peroxidases and 2) a diphenylene iodonium-sensitive
NAD(P)H oxidase (respiratory burst oxidase homologue, Rboh). In order to clear whether and how much the plasma membrane-bound peroxidases are able to participate in vitro in AOS production, their NAD(P)H oxidase activities were extensively characterized.

The full length nucleotide sequences of pmPOX1 and pmPOX2b could be identified by nanoelectrospray mass spectrometry analysis and in silico cloning of the purified proteins. Additionally, three possible sequences for pmPOX3 could be found. Relative and theoretical molecular masses and isoelectric points were compared. Several other data were deduced of the sequences, e.g. high sequence similarity to other class III peroxidases, conserved and variable regions, homologues, and putative protein structures. Bioinformatic predictions of hydrophobic domains in comparison with solubilisation experiments suggest a non-cleavable ER signal peptide for each protein, and an intrinsic binding of the pmPOXs with an N-terminal transmembrane domain. Derived from in silico northern blot analysis pmPOX1, pmPOX2b and pmPOX3 seem to be expressed mainly in roots. Possible functions of the plasma membrane-bound peroxidases were discussed.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/1210
URN: urn:nbn:de:gbv:18-27694
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Böttger, Michael (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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