Inhibition of acute Angiotensin II-induced cAMP signaling and aldosterone secretion by atrial natriuretic peptide

Abstract

Aldosterone, a steroid hormone as part of the renin-angiotensin-aldosterone system plays a crucial role in regulating blood pressure and blood volume. Aldosterone is produced by specialized cells of adrenal glands known as zona glomerulosa (ZG) cells present on the outermost layer of adrenal cortex attached to the capsule. Dysregulation of aldosterone can cause electrophysiological imbalances leading to cardiovascular and renal diseases such as hypertension, hypokalemia or alkalosis. As such, inhibitors of aldosterone synthase and receptors are crucial for the treatment of hypertension, heart failure and associated diseases. It is established that adrenocorticotropic hormone (ACTH), angiotensin II (AngII) and potassium (K+) stimulate aldosterone production. Cardiac atria produce and secrete atrial natriuretic peptide (ANP) in response to hypervolemia and hypertension due to hyperaldosteronism as a cardioprotective mechanism. Expression and activity of aldosterone at molecular level is controlled by cyclic nucleotides and phosphodiesterases. ACTH by increasing intracellular cAMP stimulates aldosterone production. K+ induces an influx of Ca2+ by depolarizing voltage gates calcium channels. AngII via its angiotensin 1 receptor (AT1R), a G-protein coupled receptor, activates phospholipase C to increase intracellular Ca2+ and stimulate the production of aldosterone. ANP via its GC-A receptor leads to increased cGMP concentration that activates phosphodiesterase type 2 (PDE2A) to degrade ACTH stimulated cAMP and inhibit aldosterone production. ANP also inhibits AngII/ AT1R stimulated aldosterone production, and although the exact molecular mechanism is unknown, it was speculated to do so via PDE2A. In this thesis, bovine adrenal ZG cells were isolated and cultured to perform CRISPR/Cas9 in vitro knockouts (KO) of PDE2A to have loss of function. From primary cell culture lysates, western blot was performed for validating the knockout model and further protein analysis. The cell media was used to perform aldosterone ELISA and measure aldosterone concentrations after pre-incubating with ANP and adding stimulants such as Forskolin (Fsk) and AngII. Intracellular cAMP and PKA activity were also measured using Förster resonance energy transfer (FRET) technique. Real time changes were shown in cAMP levels and PKA phosphorylation by using Epac2-camps and AKAR3 biosensor respectively by observing changes in FRET signals. The first experiments were conducted to validate the isolation protocol using immunostaining using aldosterone synthase (CYP11B2) and disabled-2 (Dab2) antibodies. Aldosterone ELISA measurements showed that acute aldosterone stimulated by AngII, inhibited by ANP is cGMP dependent but not calcium (Ca2+). Ca2+ -transients were observed using Calbryte 520 AM dye with and without ANP pre-incubation followed by AngII-stimulation. The CRISPR/Cas9 generated PDE2A KO ZG cells were established and validated using FRET technique. These results also showed that the inhibitory effects of ANP/GC-A/cGMP pathway were abolished in PDE2A KO cells as compared to control cells. This was also proved by aldosterone ELISA where inhibition by ANP was abolished in PDE2A KO cells suggesting a strong role of PDE2A in ANP driven kinetics of cAMP degradation. ANP also degraded cAMP stimulated by AngII suggesting that the mechanism could be cAMP-dependent. Upon overexpressing PDE4B to degrade cAMP, it was shown that aldosterone production could be completely blunted. Using the AKAR3 biosensor and phosphorylated PKA/PKG substrate antibody, inhibition of PKA by myrPKI and adenylyl cyclase blocker, MDL a decrease in AngII stimulated cAMP/PKA activity was seen. This was also translated to aldosterone levels highlighting the role of cAMP/PKA mediated pathway. The novel finding of this thesis was that AngII activates the cAMP/PKA pathway by acutely stimulating Ca2+ and Ca2+ -dependent adenylyl cyclase (AC) which was shown to be degraded by ANP. Since ANP/GC-A/cGMP pathway inhibits acute AngII stimulated cAMP/PKA pathway for aldosterone production mediated via rapid PDE2A kinetics, new therapeutic targets for this mechanism could be developed for aldosterone related diseases.

Aldosteron, ein Steroidhormon, das Teil des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS) ist, spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Blutdrucks und des Blutvolumens. Aldosteron wird von spezialisierten Zellen der Nebennieren, den sogenannten Zona glomerulosa (ZG)-Zellen, produziert, die sich in der äußersten Schicht der Nebennierenrinde befinden, die an der Kapsel befestigt ist. Eine Dysregulation von Aldosteron kann zu elektrophysiologischen Ungleichgewichten führen, die Herz-Kreislauf- und Nierenerkrankungen wie Bluthochdruck, Hypokaliämie oder Alkalose verursachen. Daher sind Inhibitoren der Aldosteronsynthase und der Aldosteronrezeptoren für die Behandlung von Bluthochdruck, Herzinsuffizienz und damit verbundenen Erkrankungen von entscheidender Bedeutung. Es ist bekannt, dass Adrenokortikotropes Hormon (ACTH), Angiotensin II (AngII) und Kalium (K+) die Aldosteronproduktion stimulieren. Die Herzvorhöfe produzieren und sezernieren als kardioprotektiven Mechanismus atriales natriuretisches Peptid (ANP) als Reaktion auf Hypervolämie und Hypertonie aufgrund von Hyperaldosteronismus. Die Expression und Aktivität von Aldosteron auf molekularer Ebene wird durch zyklische Nukleotide und Phosphodiesterasen gesteuert. ACTH stimuliert durch Erhöhung des intrazellulären cAMP die Aldosteronproduktion. K+ induziert einen Ca2+-Einstrom durch Depolarisierung spannungsgesteuerter Kalziumkanäle. AngII aktiviert über seinen Angiotensin-1-Rezeptor (AT1R), einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, die Phospholipase C, um das intrazelluläre Ca2+ zu erhöhen und die Produktion von Aldosteron zu stimulieren. ANP führt über seinen GC-A-Rezeptor zu einer erhöhten cGMP-Konzentration, die die Phosphodiesterase Typ 2 (PDE2A) aktiviert, um ACTH-stimuliertes cAMP abzubauen und die Aldosteronproduktion zu hemmen. ANP hemmt auch die durch AngII/AT1R stimulierte Aldosteronproduktion, und obwohl der genaue molekulare Mechanismus unbekannt ist, wurde vermutet, dass dies über PDE2A geschieht. In dieser Arbeit wurden bovine Nebennieren-ZG-Zellen isoliert und kultiviert, um CRISPR/Cas9-in-vitro-Knockouts (KO) von PDE2A durchzuführen, um einen Funktionsverlust zu erzielen. Aus Lysaten der Primärzellkultur wurde ein Western Blot durchgeführt, um das Knockout-Modell zu validieren und weitere Proteinanalysen durchzuführen. Das Zellmedium wurde verwendet, um einen Aldosteron-ELISA durchzuführen und die Aldosteronkonzentrationen nach Vorinkubation mit ANP und Zugabe von Stimulanzien wie Forskolin und AngII zu messen. Die intrazelluläre cAMP- und PKA-Aktivität wurde ebenfalls unter Verwendung der Förster-Resonanz-Energie-transfer-Technik (FRET) gemessen. Echtzeitänderungen der cAMP-Spiegel und der PKA-Phosphorylierung wurden unter Verwendung von Epac2-camps bzw. AKAR3-Biosensoren durch Beobachtung der Veränderungen der FRET-Signale beobachtet. Die ersten Experimente wurden durchgeführt, um das Isolierungsprotokoll mittels Immunfärbung unter Verwendung von Aldosteronsynthase (CYP11B2)- und Disabled-2 (Dab2)-Antikörpern zu validieren. Aldosteron-ELISA-Messungen zeigten, dass das durch AngII stimulierte und durch ANP gehemmte akute Aldosteron cGMP-abhängig, jedoch nicht kalziumabhängig (Ca2+) ist. Ca2+ Transienten wurden unter Verwendung des Farbstoffs Calbryte 520 AM mit und ohne ANP-Vorinkubation gefolgt von AngII-Stimulation beobachtet. Die CRISPR/Cas9-generierten PDE2A-KO-ZG-Zellen wurden etabliert und unter Verwendung der FRET-Technik validiert. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass die inhibitorischen Effekte des ANP/GC-A/cGMP-Signalwegs in PDE2A-KO-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen aufgehoben waren. Dies wurde auch durch den Aldosteron-ELISA bestätigt, bei dem die Hemmung durch ANP in PDE2A-KO-Zellen aufgehoben wurde, was auf eine wichtige Rolle von PDE2A bei der ANP-gesteuerten Kinetik des cAMP-Abbaus hindeutet. ANP baute auch das durch AngII stimulierte cAMP ab, was darauf hindeutet, dass der Mechanismus cAMP-abhängig sein könnte. Bei Überexpression von PDE4B zum Abbau von cAMP zeigte sich, dass die Aldosteronproduktion vollständig unterbunden werden konnte. Unter Verwendung des AKAR3-Biosensors und des phosphorylierten PKA/PKG-Substrat-Antikörpers wurde eine Hemmung der PKA durch MyrPKI und den Adenylylcyclase-Blocker MDL beobachtet, was zu einer Abnahme der durch AngII stimulierten cAMP/PKA-Aktivität führte. Dies spiegelte sich auch in den Aldosteronspiegeln wider, was die Rolle des cAMP/PKA-vermittelten Signalwegs unterstreicht. Die neue Erkenntnis dieser Arbeit war, dass AngII den cAMP/PKA-Signalweg durch akute Stimulation von Ca2+ und Ca2+-abhängiger Adenylylcyclase (AC) aktiviert, die nachweislich durch ANP abgebaut wird. Da der ANP/GC-A/cGMP-Signalweg den durch AngII akut stimulierten cAMP/PKA-Signalweg für die Aldosteronproduktion über eine schnelle PDE2A-Kinetik hemmt, könnten neue therapeutische Ansatzpunkte für diesen Mechanismus bei Aldosteron-assoziierten Erkrankungen entwickelt werden.