Entwicklung von LC-MS/MS-basierten Assays zur Quantifizierung und Charakterisierung der Adsorption von Analyten an Oberflächen

Abstract

Die Adsorption von Molekülen an Oberflächen ist eine unterschätzte Fehlerquelle in der Analytik. Sie kann zu Probenverlusten und falschen quantitativen Ergebnissen führen. Dieses Problem betrifft jeden Analyten. In den verschiedenen Omics-Disziplinen ist dieses Problem besonders relevant, da im Gegensatz zur Analytik einzelner oder weniger Analyten der Einsatz interner Standards nicht möglich ist. Das Ausmaß der Adsorption wird maßgeblich durch die Kombination aus verwendeter Oberfläche (feste Phase) und der Zusammensetzung des Lösungsmittels (flüssige Phase), in dem der Analyt gelöst ist, sowie durch die chemischen Eigenschaften des Analyten bestimmt. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Validierung standardisierter Assays, mit denen sich Adsorptionsprozesse von Molekülen abhängig von der flüssigen und der festen Phase reproduzierbar charakterisieren und quantifizieren lassen. Typische feste Phasen, mit denen gelöste Analyten während der Probenvorbereitung in Kontakt kommen, sind Probengefäße, Mikrotiterplatten oder Pipettenspitzen. Zur Charakterisierung der Wechselwirkungen wurden für den Assay tausende tryptische Peptide eines Referenzgemisches als Sonden gewählt, die eine große Vielfalt unterschiedlicher physikochemischer Eigenschaften bieten. Diese wurden vor und nach Kontakt mit festen Oberflächen direkt mittels differentieller Bottom-up-Proteomik unter Nutzung der Flüssigkeitschromatographie-gekoppelten Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) quantifiziert. Eine Adsorption liegt vor, wenn nach der Inkubation eine signifikante Abnahme der Menge eines Peptids in der flüssigen Phase gemessen wurde. Durch den Blick auf die chemischen Eigenschaften wie Länge, Hydrophobizität und Ladung der adsorbierten Peptide konnten Rückschlüsse auf die Art und Stärke der Wechselwirkung gezogen werden. Der entwickelte Assay wurde als „Adsorption-Properties-of-Surfaces-Assay“ (APS-Assay) bezeichnet. Der APS-Assay wurde getestet, indem die Adsorptionseigenschaften der Oberflächen von kommerziell erhältlichen Probengefäßen aus Polypropylen (PP) und Glas (G) unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels (0,1 % Ameisensäure in Wasser) untersucht wurden. PP-Gefäße wiesen eine signifikante Adsorption zahlreicher hydrophober Peptide aufgrund hydrophober Wechselwirkungen auf, während einige modifizierte PP-Oberflächen keine Adsorption zeigten. Bei Glasgefäßen konnte eine starke Adsorption einer großen Zahl von Peptiden festgestellt werden, die unter anderem durch elektrostatische Wechselwirkungen bedingt war. Die Folgen dieser Adsorption ließen sich anhand veränderter Proteinabundanzen in der differentiellen quantitativen Proteomanalytik nachweisen, was zu Fehlinterpretationen biologischer Prozesse führte. Die Analyse der chemischen Eigenschaften der adsorbierten Peptide ergab, dass auch die Sekundärstruktur die Adsorption der Peptide an Oberflächen beeinflusst. Konformationsabhängige Effekte wurden experimentell mittels Zirkulardichroismus-Spektroskopie bestätigt und bei der Etablierung des APS-Assays berücksichtigt. Zur Automatisierung der Auswertung wurde ein Python-basiertes Skript entwickelt, das eine effiziente und umfassende Bewertung der Adsorptionsprozesse ermöglicht. Auf Grundlage der APS-Assay-Ergebnisse wurde ein vereinfachter, Multiple Reaction Monitoring-basierter „Fast-Assay“ entwickelt. Die gezielte Auswahl von wenigen Peptiden aus dem Referenzgemisch mit eindeutigen chemischen Eigenschaften ermöglicht eine schnelle Quantifizierung der Adsorption bedingt durch Wechselwirkungen an Oberflächen in Abhängigkeit von den verwendeten Lösungsmitteln. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass Adsorption ein selektiver, physikochemisch determinierter Prozess ist, der bei der experimentellen Planung berücksichtigt werden sollte. Der APS-Assay und der darauf aufbauende Fast-Assay stellen Verfahren dar, mit denen sich Kombinationen von Lösungsmittel und Oberflächen ermitteln lassen, die den Verlust von Analyten durch Adsorption minimieren.

The adsorption of molecules on surfaces is an underestimated source of error in analytics. It can lead to sample losses and incorrect quantitative results. This problem affects every analyte. It is particularly relevant in the various omics disciplines, as unlike in the analysis of individual or fewer analytes, the use of internal standards is not possible. The extent of adsorption is largely determined by the combination of the surface used (solid phase) and the composition of the solvent (liquid phase) in which the analyte is dissolved, as well as by the chemical properties of the analyte. The aim of this work was to develop and validate standardized assays that can be used to reproducibly characterize and quantify adsorption processes of molecules depending on the liquid and solid phases. Typical solid phases with which dissolved analytes come into contact during sample preparation are sample vessels, microtiter plates, or pipette tips. To characterize the interactions, thousands of tryptic peptides from a reference mixture were selected as probes for the assay, offering a wide variety of different physicochemical properties. These were quantified directly before and after contact with solid surfaces using differential bottom-up proteomics coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Adsorption occurs when a significant decrease in the amount of a peptide in the liquid phase is measured after incubation. By looking at the chemical properties such as length, hydrophobicity, and charge of the adsorbed peptides, conclusions could be drawn about the type and strength of the interaction. The assay developed was named the “Adsorption Properties of Surfaces Assay” (APS-Assay). The APS-Assay was tested by examining the adsorption properties of the surfaces of commercially available sample vessels made of polypropylene (PP) and glass (G) using the same solvent (0.1% formic acid in water). PP vessels showed significant adsorption of numerous hydrophobic peptides due to hydrophobic interactions, while some modified PP surfaces showed no adsorption. In glass vessels, strong adsorption of a large number of peptides was observed, which was in part caused by electrostatic interactions. The consequences of this adsorption could be demonstrated by altered protein abundances in differential quantitative proteomics, which led to misinterpretations of biological processes. Analysis of the chemical properties of the adsorbed peptides revealed that the secondary structure also influences the adsorption of peptides to surfaces. Conformation-dependent effects were confirmed experimentally using circular dichroism spectroscopy and taken into account when establishing the APS-Assay. A Python-based script was developed to automate the evaluation, enabling efficient and comprehensive assessment of the adsorption processes. Based on the APS-Assay results, a simplified, multiple reaction monitoring-based “Fast-Assay” was developed. The targeted selection of a few peptides from the reference mixture with unique chemical properties enables rapid quantification of adsorption due to interactions at surfaces depending on the solvents used. The results illustrate that adsorption is a selective, physicochemically determined process that should be taken into account in experimental planning. The APS-Assay and the Fast-Assay based on it are methods for determining combinations of solvents and surfaces that minimize the loss of analytes through adsorption.