Plastic particles in seafood – A case study of commercially relevant products of the German market as baseline for future microplastic monitoring in fresh and processed seafood products

Abstract

Plastics have become indispensable in nearly all areas of human life due to their versatility, durability, and chemical resistance. However, their widespread use and release into the environment, combined with their persistence, have resulted in considerable environmental pollution. A particularly concerning aspect of this pollution involves micro- and nanoscale plastic particles. These particles originate from intentional production, wear and tear of plastic products, and environmental degradation of plastic waste. Known as micro- and nanoplastic, these persistent particles are readily transported across the globe due to their low density and small size, entering all environmental compartments, and the food chain.

The ubiquitous presence of plastic particles has raised not only environmental concerns but also growing concerns regarding human health. Micro- and nanoplastic have been detected in human samples, ranging from stool, sperm, and blood to organs such as liver, heart, placenta, or brain. Their potential impacts, such as on the immune system, carcinogenesis, cardiovascular health, and reproductive systems have been critically discussed in recent years. Inhalation and ingestion are the primary exposure routes for humans. Yet, the extent of plastic exposure and associated health risks are still largely unknown.

Plastic pollution is especially prevalent in marine and freshwater ecosystems, exposing aquatic organisms to significant levels of micro- and nanoplastic. These particles are taken up by the organisms, transferred along the food chain, and potentially accumulate in tissues. Consequently, seafood consumption is believed to significantly contribute to human dietary intake of plastic particles. Accurate exposure assessment is essential to evaluate the potential risks to seafood safety posed by micro- and nanoplastic. Data on the plastic occurrence in edible seafood tissues is limited and often of limited reliability due to the absence of validated, standardized analytical methods, though.

This dissertation is based on projects on assessing plastic particles in edible parts of seafood products. The primary aim of the projects was to contribute to the risk assessment of micro- and nanoplastic presence in food, focusing on seafood. To this end, methods for sensitive and high-throughput analysis of microplastic in edible seafood tissues were developed, following the guidance of ongoing standardization efforts. These methods were preliminarily validated to accurately quantify microplastic in seafood. Subsequently, microplastic was analyzed in seafood of commercially relevant species from different phyla, and origin, aiming to estimate the dietary plastic intake via seafood consumption in Germany. Products with different degrees of processing were analyzed to account for the broad variety of potential plastic contamination routes along the seafood supply chain. These objectives were addressed in four peer-reviewed publications which form the foundation of this cumulative dissertation.

Microplastic was analyzed in edible tissues of fish, crustaceans and mollusks with fluorescence imaging and pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry (Py-GC/MS). The analysis accounted for the commercially most relevant polymers, namely polyamide, polyethylene, polyethylene terephthalate, polypropylene, polystyrene, and polyvinylchloride.

To prepare seafood samples without compromising polymer integrity, a digestion protocol using pepsin and potassium hydroxide was established. While alkaline hydrolysis is widely used for digesting biological tissues in microplastic analysis, the implementation of an enzymatic step improved digestion efficiency, reducing incubation time by 16 h, and temperature by 20 °C. This optimization minimized damage to polymer structures and enhanced sample throughput. Pressure-assisted filtration, an effective alternative to commonly used vacuum filtration, was employed to extract and enrich microplastic. This method enabled the filtration of up to 100 g of tissue – ten times the amount possible with vacuum filtration – thereby improving sensitivity and reproducibility. The refined protocol also allowed for filtration using a single membrane filter with a 1 µm pore size, avoiding plastic loss due to larger pores or extended analysis time when distributing one sample across multiple filters.

Sensitive quantification of microplastic particle counts was achieved by developing a method based on fluorescence microscopy after tagging microplastic with the fluorescent marker Nile red. A two-step staining protocol using Nile red in hexane and ethanol:acetone effectively labeled polymers of different chemical polarity. The fluorescence of natural organic matter, such as chitin, tissue residues, or fishbone was quenched using Evans blue dye. Semi-automated imaging and computer-aided analysis improved throughput and reduced observer bias, a common limitation in microscopic analyses. To complement the optical method, mass-based approaches were evaluated for quantifying microplastic mass content and identifying polymer types. Py-GC/MS was identified as the most appropriate method regarding sensitive, specific, and accurate quantification of a broad variety of polymers.

The analysis of 130 fresh and processed seafood products intended for human consumption documented the occurrence of plastic particles (≥ 5 µm) in 94 % of samples. A high variability of microplastic contents was observed, with up to 183 particles and 2.66 µg of plastic per gram wet weight respectively, which is consistent with findings from other studies across the globe. Based on seafood consumption patterns in Germany, an annual intake of approximately 16,500 particles per capita and year was estimated. 97 % of detected particles were smaller than 150 µm, the upper particle size limit that can cross the intestinal barrier, suggesting that a large proportion of ingested plastic was potentially bioavailable. Microplastic counts were highest in fresh and canned products, with no significant differences between products of different species or origin. A potential influence of processing and packaging on plastic occurrence in the food products, as well as high numbers of plastic particles ≤ 5 µm were indicated.

The data obtained within this work contributes to the ongoing assessment of human dietary exposure to plastic particles. Various entry points for plastic contamination in seafood products beyond environmental exposure were indicated and warrant further investigation. High numbers microplastic particles smaller than 5 µm in seafood products highlight the need for further method development, particularly for nanoplastic analysis. Although the developed methodology does not meet all criteria for analytical methods used in the context of official controls, it provides a basis for the ongoing standardization of microplastic analysis in food, particularly seafood.

Kunststoffe sind aufgrund ihrer Vielseitigkeit, und hohen chemischen sowie mechanischen Beständigkeit aus dem Alltag nicht mehr wegzudenken. Ihr weitreichender Einsatz, die teilweise unkontrollierte Freisetzung in die Umwelt und ihre hohe Persistenz haben zu erheblicher Umweltkontamination geführt. Mikro- und nanoskalige Kunststoffpartikel stellen dabei einen besonders kritischen Aspekt dar. Diese Partikel werden gezielt hergestellt, entstehen jedoch auch durch Abrieb oder Zerfall von Kunststoffen in der Umwelt. Die als Mikro- und Nanoplastik bezeichneten Partikel verbreiten sich aufgrund ihrer geringen Größe und Dichte weltweit und gelangen in sämtliche Umweltkompartimente sowie in die Nahrungskette. Neben Umweltrisiken wächst die Sorge über Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit. Mikro- und Nanoplastik wurde im Menschen in Blut, Fäzes, Sperma sowie Organen wie Leber, Herz, Plazenta und Gehirn nachgewiesen. Mögliche Effekte, wie auf das Immunsystem, die Fruchtbarkeit, oder die Entstehung von Krebs- oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen, werden kritisch diskutiert. Hauptaufnahmewege für Mikro- und Nanoplastik sind Inhalation und Ingestion, zum Beispiel durch den Verzehr kontaminierter Lebensmittel, doch sind Exposition und Gesundheitsfolgen noch unzureichend erforscht.

Gewässer wie Meere und Flüsse – und somit auch aquatische Organismen – sind besonders stark von Mikro- und Nanoplastik betroffen. Diese Partikel können leicht aufgenommen, entlang der Nahrungskette weitergegeben und in Organismen angereichert werden. Der Verzehr von Fischereierzeugnissen gilt daher als eine relevante Quelle für Plastikpartikel in der menschlichen Ernährung. Eine belastbare Expositionsbewertung ist derzeit jedoch aufgrund begrenzter Datenlage zum Plastikvorkommen in essbarem Gewebe von Fisch und Meeresfrüchten nur eingeschränkt möglich. Zudem mangelt es an validierten und standardisierten Analysemethoden, sodass vorhandene Daten schwer bewertet werden können.

Diese Dissertation basiert auf Arbeiten zur Erfassung von Mikroplastik in essbarem Gewebe von Fisch, Krebs- und Weichtieren. Das Hauptziel der Arbeit war es, einen Beitrag zur Expositionsabschätzung und damit zur Risikobewertung von Kunststoffpartikeln in Lebensmitteln, vor allem Fischereierzeugnisse, zu leisten. Unter Berücksichtigung aktueller Standardisierungsvorhaben wurden hierfür empfindliche und genaue Methoden mit hohem Probendurchsatz entwickelt und vorläufig validiert. Zur Einschätzung der alimentären Exposition gegenüber Mikroplastik durch den Verzehr von Fischereierzeugnissen in Deutschland wurden kommerziell relevante Arten unterschiedlicher Gattung und Herkunft untersucht. Um die große Vielfalt potenzieller Kontaminationsquellen entlang der Produktionskette abzubilden, wurden Produkte mit unterschiedlichem Verarbeitungsgrad untersucht. Diese Ergebnisse wurden in vier Publikationen bei Fachzeitschriften mit Peer-Review-Verfahren veröffentlicht, welche die Grundlage der vorliegenden kumulativen Dissertation bilden.

Mikroplastik wurde im essbaren Anteil von Fisch-, Krebs- und Weichtieren mit einer Kombination aus Fluoreszenz Imaging und Pyrolyse-Gaschromatographie-Massenspektrometrie (Py-GC/MS) nachgewiesen. Die Methoden erfassen die kommerziell relevantesten Polymere, darunter Polyamid, Polyethylen, Polyethylenterephthalat, Polypropylen, Polystyrol, und Polyvinylchlorid.

Durch Entwicklung eines enzymatisch-alkalischen Probenaufschluss mit Pepsin und Kalilauge wurde essbares Gewebe von Fisch und Meeresfrüchten effizient hydrolysiert ohne relevante Polymere zu schädigen. Durch zusätzliche enzymatische Hydrolyse wurden Inkubationszeit um 16 h und Temperatur um 20 °C im Vergleich zu bisher eingesetzten Methoden reduziert, wodurch schädigende Wirkung minimiert und Probendurchsatz erhöht wurden. Die anschließende Druckfiltration erwies sich als effiziente Alternative zur herkömmlichen Vakuumfiltration. Dadurch konnte die zehnfache Probenmenge (ca. 100 g) im Vergleich zur bisherigen verarbeitet werden, was sowohl die Empfindlichkeit als auch die Präzision der Methode erhöhte. Das optimierte Verfahren ermöglichte die Filtration mit einem Filter von 1 µm Porengröße, wodurch Verluste von Mikroplastik mit kleineren Durchmessern als die Porengröße oder eine längere Analysenzeit durch den Einsatz mehrerer Filter vermieden wurden.

Es wurde eine Methode basierend auf Fluoreszenz-Imaging nach Nilrot-Färbung für die empfindliche Detektion von Mikroplastikpartikeln entwickelt. Zur Erfassung von Polymeren unterschiedlicher chemischer Polarität wurden die Proben mit Nilrot gefärbt, das in Hexan oder in einem Ethanol:Aceton-Gemisch gelöst vorlag. Die Fluoreszenz natürlicher Materialien, wie Chitin, Gewebereste oder Gräten wurde durch Färbung mit Evans Blau unterdrückt. Mit semi-automatischem Imaging und computergestützter Bildauswertung wurden Probendurchsatz erhöht und der Observer-Bias reduziert. Zur Ergänzung optischer Methoden wurden massenbasierte Verfahren hinsichtlich ihrer Eignung zur Quantifizierung von Polymergehalten verglichen. Als am besten geeignet für den empfindlichen, spezifischen und präzisen Nachweis einer Vielzahl polymerer Verbindungen in Fischereierzeugnissen erwies sich die Py-GC/MS.

Bei der Untersuchung von 130 Fischereierzeugnissen des deutschen Marktes wurde in 94 % der Produkte Mikroplastik (Ø ≥ 5 µm) nachgewiesen. Die Menge schwankte dabei stark und erreichte bis zu 183 Partikel oder 2,66 µg Mikroplastik je Gramm Frischgewicht, was mit anderen Studien weltweit vergleichbar ist. Ausgehend vom durchschnittlichen Fischverzehr in Deutschland werden jährlich etwa 16.500 Plastikpartikel pro Person aufgenommen. 97 % der nachgewiesenen Partikel waren kleiner als 150 µm, was der oberen Grenze potenziell bioverfügbarer Partikel entspricht. Am meisten Mikroplastik wurde in frischen Produkten und Konserven gefunden, ein Einfluss von Spezies oder Herkunft wurde nicht beobachtet. Die Ergebnisse deuten jedoch auf einen möglichen Einfluss von Verarbeitung und Verpackung sowie auf ein erhöhtes Vorkommen von Partikeln mit Durchmessern kleiner gleich 5 µm hin.

Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten leisten einen Beitrag zur Untersuchung der Exposition des Menschen gegenüber Mikroplastik durch die Ernährung. Ein Eintrag von Mikroplastik in das Lebensmittel durch Verarbeitung und Verpackung wurde angedeutet, bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. Das hohe Vorkommen von Plastikpartikeln kleiner als 5 µm verdeutlicht, dass weitere Methodenentwicklung, insbesondere für die Nanoplastik-Analytik notwendig ist. Obwohl die entwickelten Methoden nicht alle Kriterien für Analyseverfahren erfüllt, die im Rahmen offizieller Lebensmittelkontrollen eingesetzt werden, stellen die im Rahmen der Arbeit etablierten Verfahren eine Grundlage für weitere Standardisierungsarbeiten zur Analyse von Mikroplastik in Lebensmitteln dar.