ADP-Ribosyltransferase-Aktivität auf der Zelloberfläche von Lymphozyten

Abstract

Bei der ADP-Ribosylierung wird die ADP-Ribose-Gruppe von NAD auf ein Zielproteie übertragen. Bekanntermaßen hemmen z.B. Cholera- und Pertussistoxin die Signaltransduktion in Wirtszellen durch ADP-Ribosylierung von G-Proteinen. Ziel dieser Arbeit ist, toxin-verwandte ADP-Ribosyltransferasen (ARTs) auf der Zelloberfläche von Lymphozyten, die durch Modifikation von Membranproteinen elementare Zellfunktionen beeinflussen, näher zu charakterisieren. Eine zentrale Rolle spielt bei diesen Untersuchungen ein hier neu etablierter Antikörper-basierter Assay zum Nachweis von ADP-Ribosylierung auf der Zelloberfläche. Mit diesem Assay können etheno-ADP-ribosylierte Membranproteine nach Inkubation von vitalen Zellen mit etheno-NAD mit dem monoklonalen etheno-Adenosin-spezifischen Antikörper 1G4 in FACS-Analysen, in der Immunofluoreszenzmikroskopie und im Western Blot detektiert werden. Analysen der Dosis-Wirkungs-Beziehung und der Kinetik mit ART-transfizierten Lymphomzellen und bei primären Lymphozyten zeigten eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei niedrigen mikromolaren etheno-NAD-Konzentrationen und eine Sättigung der Reaktion innerhalb weniger Minuten. Mit dem P2X7 Purinozeptor wurde ein wichtiges Zielprotein der ART2 auf murinen T Zellen identifiziert. Die Aktivierung von P2X7 durch ADP-Ribosylierung induziert die zelluläre Apoptose. Dieser sogenannte NAD-induzierte Zelltod konnte mit endogenem NAD, das von lysierten Zellen freigesetzt wird, ausgelöst werden. Es wurde der Frage nachgegangen, inwiefern die Verfügbarkeit von extrazellulärem NAD als Substrat für ART2 durch enzymatischen Abbau des NADs begrenzt wird. Dabei konnte gezeigt werden, dass die von B Zellen exprimierte NADase CD38 in der Tat den Grad der Zelloberflächen-ADP-Ribosylierung auf T Zellen beeinflusst. Ferner konnte mit dem 1G4-basierten Assay die Verteilung von ART-Aktivität auf lymphatischen Zellen verschiedener Spezies bestimmt werden. Bei in silico Untersuchungen wurden zudem bisher unbekannte Vertreter der ART-Familie bei Hühnern entdeckt, die wahrscheinlich Verwandte der Säuger-ART1 bzw. ART5 sind. In dieser Arbei wird der Frage nachgegangen, ob die ADP-Ribose-Gruppe von Membranproteinen vollständig oder teilweise entfernt wird, z.B. durch ADP-Ribosylhydrolasen (ARHs) und Nukleotid-Pyrophosphatasen/Phosphodiesterasen (NPPs). Bei murinen T Zellen konnte in vitro ein Rückgang der Zelloberflächen-ADP-Ribosylierung nachgewiesen werden, der sich mit Inhibitoren der ARHs und NPPs hemmen ließ. Nach intravenöser Applikation von etheno-NAD bei Mäusen wurde auch in vivo reversible etheno-ADP-Ribosylierung von Membranproteinen auf T Zellen in FACS-Analysen detektiert. Zusammengenommen, unterstützen die Ergebnisse dieser Arbeit die Hypothese, dass NAD als „danger-signal“ wirkt und bei Entzündungsreaktionen freigesetzt wird, um die ungewollte Aktivierung von naïven „bystander“ T Zellen zu verhindern.

ADP-ribosylation is the transfer of the ADP-ribose moiety from NAD to target proteins. It is well known as the action of mechanism of several bacterial toxins. Cholera- and Pertussis-toxin inhibit intracellular signal transduction by ADP-ribosylation of G-proteins. The aim of this study was to investigate the action of toxin-related ADP-ribosyltransferases (ARTs) on the cell surface of lymphocytes that influence important cellular functions by modification of membrane proteins in more detail. An antibody-based assay that allows detection of cell surface ADP-ribosylation was established. Upon incubation of vital cells with etheno-NAD, cell surface etheno-ADP-ribosylation of membrane proteins can be detected with monoclonal antibody 1G4 in FACS analysis, immunofluorescence microscopy, and Western blot analysis. Studies of dose-responses and kinetics with ART-transfected cells and primary lymphocytes revealed a maximal velocity of reaction at low micromolare etheno-NAD concentrations and saturation of reaction within a few minutes. The P2X7 purinoceptor was identified as an important target protein of ART2 on murine T cells. Activation of P2X7 by ADP-ribosylation induces cellular apoptosis. Endogenous NAD that was liberated by lysis of cells was also sufficient to trigger this so called NAD-induced cell death. Another aim of this study was to investigate if and how availability of the ART2-substrate NAD is limited by enzymatic degradation of extracellular NAD. It was shown that the membrane bound NADase CD38 expressed by B cells could, indeed, influence the level of cell surface ADP-ribosylation of T cells. The 1G4-based assay was used to determine the distribution of ART-activity on lymphatic cells of different species. Furthermore, in silico experiments revealed hitherto unknown members of the ART family in chicken that probablyare related to mammalian ART1 and ART5. In addition the question was raised if the ADP-ribose moiety could be cleaved completely or in parts from membrane proteins, for example by ADP-ribosylhydrolases (ARHs) and nucleotide-pyrophosphatases/phosphodiesterases (NPPs). Reduction of cell surface ADP-ribosylation could be detected in vitro on murine T cells. This reduction could be blocked by inhibitors of ARHs and NPPs. Reversible etheno-ADP-ribosylation could also be detected in vivo on the cell suface of murine T cells upon intravenous application of etheno-NAD. Taken together, these results support the hypothesis of NAD as a “danger-signal” that is released from damaged cells during inflammation and that suppresses the activation of naïve “bystander” T cells.