Characterisation of XPR1 functions regulating CD4+ T-cell responses

Abstract

Xenotropic and polytropic retrovirus receptor 1 (XPR1) is the only known phosphate exporter in mammalian cells, whose abrogation leads to embryonic lethality in mice. Recent findings suggest that XPR1 has a role in signal transduction, complex formation, and protein trafficking extending its function beyond phosphate homeostasis and indicating a potential function of XPR1 in immunoregulation. This work therefore investigates XPR1 in CD4+ T cells to unveil novel therapeutic approaches to modulate immune responses. We found that conditional Xpr1 knockout in T cells led to altered development and selection in the thymus. Mature XPR1 deficient CD4+ T cells showed hyperactivation and increased expression of Il2, as well as increased effector functions in response to antibody-mediated stimulation. In particular, XPR1 deficiency increased proliferation, cytokine expression, and induced a moderate shift towards a glycolytic metabolic phenotype in CD4+ T cells without changes in phosphate homeostasis. In vitro differentiation assays revealed increased expression of the proinflammatory cytokines TNF α and IFN γ, and IL-22, under Th1- and Th17-skewing conditions in XPR1 deficient T cells, respectively. Likewise, human Jurkat cells showed increased expression of TNFA, IFNG, and IL22 upon siRNA-mediated XPR1 knockdown in qPCR analyses. Moreover, antigen-specific stimulation of Marilyn CD4+ T cells by intravenous injection of the cognate H-Y antigen resulted in hyperactivation, increased expression of the immune checkpoint molecules CTLA-4 and PD 1, and increased expression of the proinflammatory cytokines IL 17a and IL 22 in XPR1 deficient T cells in vivo. T cell receptor (TCR) downstream signalling was altered in XPR1 deficient CD4+ T cells, demonstrated by impaired Ca2+ influx, ERK1/2 phosphorylation, and nuclear NFAT translocation, as well as increased AKT and S6 phosphorylation, indicating a hyperactivation of PI3K-AKT-mTOR signalling. Homeostatic expansion experiments revealed a proliferation disadvantage of XPR1 deficient CD4+ T cells, while α-CD28 stimulation elicited a proliferative response in XPR1 deficient, but not control CD4+ T cells, even in the absence of α CD3 in vitro. This portrays XPR1 as a negative regulator of CD4+ T cell responses that restricts CD28-dependent co stimulation during T-cell hyperactivation. Mechanistically, we report the interaction of XPR1 with the scaffolding protein Kidins220, which has been previously associated with TCR downstream signalling and immune synapse formation. To disrupt the interaction of XPR1 with Kidins220, we devised the cell-penetrating peptide Tat-X featuring the last 25 amino acids of XPR1’s C terminal loop, which promoted T-cell proliferation, thereby phenocopying hyperactivated XPR1 deficient CD4+ T cells. Thus, XPR1 targeting may provide a potential tool for immunotherapy to invigorate insufficient T cell responses.

Xenotropic and polytropic retrovirus receptor 1 (XPR1) ist der bisher einzig bekannte Phosphat-Exporter in Säugetieren, dessen Knockout im Embryo-Stadium von Mäusen lethal ist. Obwohl die XPR1-vermittelte Regulation von Phosphat-Homöostase ein zentraler Aspekt der XPR1 Forschung ist, legt die Interaktion von XPR1 mit verschiedenen Proteinen, die an Immun-Zell-Signalwegen, Komplexbildung und Trafficking beteiligt sind, eine Relevanz von XPR1 für die Immunmodulation nahe. Daher befasst sich diese Arbeit mit der Rolle von XPR1 in T-Zellen, um neuartige Ansätze für Immun-Modulations-Therapeutika zu eröffnen. Ein konditioneller Knockout von XPR1 in CD4+ T-Zellen führte zu Veränderungen in Entwicklung und Selektionsprozessen im Thymus. XPR1-defiziente T-Zellen aus der Milz zeigten eine Hyperaktivierung und erhöhte Il2-Expression sowie gesteigerte Effektor-Funktionen in Antwort auf Antikörper-vermittelte T Zell-Rezeptor (TZR)-Stimulation. Insbesondere erhöhte die Abwesenheit von XPR1 in CD4+ T-Zellen deren Proliferation und Zytokin-Expression und bewirkte eine Verschiebung in Richtung eines glykolytischen metabolischen Phänotyps, ohne die Phosphathomöostase zu verändern. In vitro-Differenzierungs-Assays zeigten eine erhöhte Expression der proinflammatorischen Zytokine TNF α und IFN γ sowie IL-22, unter Th1- beziehungsweise Th17-induzierenden Bedingungen in XPR1 defizienten T-Zellen. Ebenso zeigten humane Jurkat-Zellen nach siRNA-vermitteltem XPR1-Knockdown in qPCR-Analysen eine erhöhte Expression von TNF-α, IFN-γ und IL-22. Des Weiteren resultierte eine antigen-spezifische Aktivierung von Marilyn-CD4+ T-Zellen mittels intravenöser Injektion von H-Y-Peptid in erhöhter Aktivierung und erhöhter Expression der Immun-Checkpoint-Moleküle CTLA-4 und PD-1 sowieso der proinflammatorischen Zytokine IL 17a und IL 22 in XPR1-defizienten T Zellen. TZR-vermittelte Signalwege zeigten Veränderungen in XPR1-defizienten T Zellen, was durch verringerten Ca2+-Influx, ERK1/2-Phosphorylierung und nukleäre NFAT-Translokation, sowie erhöhte AKT- und S6-Phosphorylierung deutlich gemacht wurde. Dies deutet auf eine Hyperaktivierung des PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs hin. Homöostatische Expansions-Experimente ergaben, dass XPR1-defiziente T-Zellen einen Nachteil gegenüber Kontrollzellen bezüglich der Proliferation in vivo aufweisen, während eine Stimulation allein mit α-CD28 ohne α-CD3 in vitro ausreichte, um eine Proliferation in XPR1-defizienten, nicht aber in Kontroll-CD4+ T-Zellen hervorzurufen. Dies zeigt, dass XPR1 als negativer Regulator von CD4+ T-Zell-Antworten fungiert und die CD28-abhängige Kostimulation einschränkt, um eine T-Zell-Hyperaktivierung zu verhindern. Auf mechanistischer Ebene konnten wir die Interaktion von XPR1 und Kidins220 zeigen, einem Adaptor-Protein, das bereits zuvor mit TZR-Signalwegen und der Bildung der Immun-Synapse in Verbindung gebracht wurde. Um die Interaktion von XPR1 mit Kidins220 zu blockieren, wurde das neuartige, zellpenetrierende Peptid Tat-X aus den letzten 25 Aminosäuren der C-terminalen Schleife von XPR1 entwickelt. Tat-X-Behandlung inhibierte die Interaktion von XPR1 und Kidins220, und förderte darüber hinaus die T-Zell-Proliferation, analog zur Hyperaktivierung XPR1-defizienter CD4+ T-Zellen. Zusammenfassend stellt XPR1 daher ein potentielles Ziel für die Immuntherapie dar, um unzureichende T-Zell-Antworten zu verstärken.