The Role of CD44 in the Induction of Myeloid-Derived Suppressor Cells by Hepatic Stellate Cells

Abstract

Chronic liver diseases are characterized by persistent inflammation and the development of a profibrotic microenvironment, ultimately leading to liver fibrosis. These processes are driven by dynamic interactions between immune and stromal cells. Myeloid-derived suppressor cells (MDSC) are key players in this context, arising in response to ongoing stimulation by pathological conditions such as infection, chronic inflammation or cancer, exerting immunosuppressive traits and hence contributing both to hepatic stellate cell (HSC) activation and fibrogenesis, and, paradoxically, to protection against excessive immune-mediated tissue damage. HSC, recognized as central mediators of liver fibrosis and immune regulation, have been shown in studies such as those by Höchst et al. to induce monocytic MDSCs (mMDSC) from peripheral blood monocytes (PBMC) via CD44-dependent mechanisms. However, the precise mechanisms underlying this CD44-dependent induction remain poorly understood. This study further explores the role of CD44 in MDSC induction using both murine and human models. To expand on current knowledge and gain deeper insights, we aimed to determine whether the role attributed to CD44 is maintained in a murine in vitro model of MDSC induction. Therefore, a HSC isolation protocol was established, involving enzymatic in situ liver perfusion, digestion, gradient purification, and finally, FACS-based sorting. Upon seven days of culture activation of primary quiescent ex vivo HSC, we observed a significant upregulation of surface CD44. MDSC can be generated in vitro by culturing isolated bone marrow cells (BMC) in GM-CSF-containing medium. HSC has been shown to crucially boost this MDSC induction. Therefore, as a model for HSC-mediated MDSC generation, we cultured BMC on a confluent monolayer of activated HSC in GM-CSF-supplemented medium. We then compared MDSC generated in the presence of HSC from CD44 wild-type mice to those generated in presence of HSC from CD44-deficient mice. The absence of CD44 on HSC did not change MDSC induction as assessed by typical MDSC surface marker expression. However, when assessing MDSC suppressive capacity, our preliminary data suggest that CD44 expression on HSC enhances the immunosuppressive function of MDSC. Moreover, these findings demonstrate the suitability of murine models for further investigating the role of CD44 in HSC-mediated MDSC induction. The human model aimed to clarify the necessity of HSC as a cellular context in CD44-mediated MDSC induction and to determine whether recombinant CD44 alone could induce mMDSC from CD14+ PBMC. To investigate the effects of CD44 on MDSC induction, an in vitro model was established by treating CD14+ PBMC with GM-CSF with or without TGF-β1. It was demonstrated that GM-CSF primarily drives HLA-DR downregulation, whereas TGF-β1 expands the mMDSC population and enhances suppressive capacities. The experimental setup was then modified by using CD44-coated culture dishes, hypothesizing that CD44 could activate MDSC-relevant pathways within CD14+ PBMCs and thereby enhance their phenotypic and/or functional characteristics. However, flow cytometric analysis of in vitro-generated MDSCs in the presence of CD44 revealed no alterations in MDSC frequency or key surface markers. Furthermore, functional assessments using T cell suppression assays showed no enhanced suppressive properties in MDSC generated in the presence of recombinant CD44. Our in vitro findings indicate that CD44, in the absence of its cellular context, is insufficient to replicate the effects observed in HSC-dependent MDSC induction. These findings of our human model emphasize the essential yet context-dependent role of CD44 in MDSC induction by HSCs.

Chronische Lebererkrankungen sind gekennzeichnet durch persistierende Inflammation mit Etablierung eines profibrotischen Mikromilieus, was letztlich zur hepatischen Fibrosierung führt. Diese Prozesse werden durch dynamische Wechselwirkungen zwischen Immun- und Stromazellen vermittelt. Myeloische Suppressorzellen (MDSC) spielen in diesem Kontext eine zentrale immunregulatorische Rolle. Sie entstehen infolge einer chronischen Stimulation im Rahmen von Pathologien wie Infektionen, chronische Inflammation oder Tumoren, entfalten immunsuppressive Eigenschaften und tragen so sowohl zur Aktivierung hepatischer Sternzellen (HSC) und damit zur Fibroseentwicklung als auch - paradoxerweise - zum Schutz vor überschießenden immunvermittelten Gewebeschäden bei. HSC, die als zentrale Vermittler fibrogener Prozesse sowie immunmodulatorischer Mechanismen gelten, wurden in Studien - u. a. von Höchst et al. - als Induktoren monozytärer MDSC (mMDSC) aus peripheren Blutmonozyten (PBMC) beschrieben. Dieser Prozess zeigte sich CD44-abhängig. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind bislang jedoch nur unzureichend verstanden. Die vorliegende Arbeit untersucht daher weiterführend die Rolle von CD44 in der MDSC-Induktion in murinen und humanen Modellsystemen. Zur Überprüfung der Übertragbarkeit bisheriger Erkenntnisse auf ein murines In-vitro-Modell wurde zunächst ein Protokoll zur Isolation primärer HSC etabliert, das auf enzymatischer in situ Leberperfusion, Dichtegradientenzentrifugation und anschließender FACS-basierter Zellselektion beruht. Nach siebentägiger Kulturaktivierung zeigten die HSC eine progrediente Oberflächenexpression von CD44. Die Ko-Kultivierung aktivierter HSC mit murinen Knochenmarkzellen (BMC) in GM-CSF-haltigem Medium führte zur Induktion von suppressiven MDSC. Im Anschluss wurden MDSC aus Ko-Kulturen mit HSC von CD44 Wildtyp-Mäusen mit solchen aus CD44-defizienten Mäusen verglichen. Während die Abwesenheit von CD44 auf HSC die MDSC-Induktion - gemessen anhand von typischen MDSC-Oberflächenmarkern - nicht beeinflusste, deuten erste funktionelle Analysen darauf hin, dass CD44 entscheidend für die Entwicklung der immunsuppressiven Kapazität der MDSC ist. Diese Ergebnisse bestätigen nicht nur die fundamentale Rolle von CD44 auch im murinen Kontext, sondern auch die Eignung muriner Modelle zur weiteren Forschung an der CD44-vermittelten MDSC-Induktion durch HSC. Im humanen Modellsystem wurde untersucht, ob CD44 allein - ohne zellulären Kontext von HSC - zur Induktion von mMDSC aus CD14+ PBMC ausreicht. Hierfür wurde ein in-vitro-Modell etabliert, in dem CD14+ PBMC mit GM-CSF - mit oder ohne Zugabe von TGF-β1 - behandelt wurden. Es zeigte sich, dass GM-CSF primär zur HLA-DR-Runterregulation führt, während TGF-β1 die Expansion und Suppressor Funktionen verstärkte. Anschließend wurde die Hypothese geprüft, ob rekombinantes CD44 - durch Beschichtung von Kulturplatten - MDSC-relevante Signalwege aktivieren und so deren Phänotyp oder Funktion modulieren könnte. Die Analyse mittels Durchflusszytometrie ergab keine Veränderungen in ihrer Häufigkeit oder Oberflächenmarkern der generierten MDSC. Auch funktionelle Suppressions-Assays zeigten keine veränderte immunsuppressive Funktion. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass CD44 allein - ohne zellulären Kontext - nicht ausreicht, um die beobachteten Effekte bei der HSC-abhängigen MDSC-Induktion zu reproduzieren. Die Daten aus dem humanen Modell deuten damit auf die stark kontextabhängige Rolle von CD44 in der MDSC-Induktion durch HSC hin.