Untersuchungen zu Calcium-mobilisierenden Adenin-Nucleotiden in humanen T-Lymphocyten

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Funktion der beiden putativen Botenstoffe Nicotinsäure-Adenindinucleotid-2'-Phosphat (NAADP) und Adenosin-Diphosphoribose (ADPR) bei der Erzeugung von Ca2+-Signalen in T-Lymphocyten untersucht. Der Ryanodin-Rezeptor-Agonist NAADP ist vermutlich an initialen Ca2+-Signalen nach Stimulation beteiligt [1]. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit zwei Verfahren etabliert, um intrazelluläre NAADP-Konzentrationen zu bestimmen: Durch HPLC-Analytik mit Fluoreszenzderivatisierung war eine Quantifizierung mit einem Detektionslimit von 500 fmol möglich. Dieses Verfahren war zwar zur Bestimmung zellulärer NAADP-Mengen nicht ausreichend empfindlich, aber es konnte erstmals gezeigt werden, daß sich NAADP direkt zu fluoreszierendem 1,N6-Etheno-NAADP umsetzen läßt. Als alternative Methode wurde ein Enzym-Assay entwickelt, mit dem NAADP-Mengen mit einem Detektionslimit von bis zu 25 fmol quantifizierbar waren. In Zellen endogen vorkommende andere Nucleotide zeigten keine Interferenz mit dem Enzym-Assay. Außerdem wurde eine Technik zur Extraktion von NAADP aus T-Lymphocyten entwickelt, bei der störende Substanzen durch eine Festphasenextraktion entfernt wurden. Mit dem entwickelten Verfahren wurden basale NAADP-Konzentrationen in humanen T-Lymphocyten von 6,6+/-1.6nM (n = 4, Mittelwert+/-SEM) bestimmt. TRPM2 ist ein für Ca2+ und Na+ permeabler Ionenkanal, der durch ADPR aktiviert wird [2]. Daher wurde eine HPLC-Methode entwickelt, die erstmalig die Quantifizierung von zellulärem ADPR erlaubte [3]. Durch zwei unterschiedliche HPLC-Verfahren sowie die Bestimmung des UV-Spektrums wurde die Identität und Reinheit des ADPR-Peaks gezeigt. Mit der Methode wurde in humanen T-Lymphocyten eine basale ADPR-Konzentration von 44+/-11 µM (n = 26, Mittelwert+/-SD) bestimmt, die bei Stimulation der Zellen mit einer hohen Konzentration des Lektins Concanavalin A auf etwa das 1.5fache anstieg [4]. Diese Erhöhung der ADPR-Konzentration führte zur Aktivierung von TRPM2. Durch RT-PCR wurde bestätigt, daß Jurkat T-Lymphocyten mehrere TRPM2-Isoformen exprimieren. Die pharmakologische Charakterisierung des durch Stimulation ausgelösten Ca2+-Einstroms ergab, daß zusätzlich zu dem bekannten Ca2+-Einstrom durch den CRAC-(Calcium release activated channel)-Kanal [5] mindestens eine weitere Komponente auftrat, die durch Hemmung der ADPR-Bildung blockiert werden konnte. Eine Beteiligung der Src-Kinasen p59fyn und p56lck konnte mit dem Kinase-Inhibitor PP2 gezeigt werden, während eine Rolle des Ekto-Enzyms CD38 bei der Erzeugung des Ca2+-Signals ausgeschlossen wurde. Die physiologische Relevanz des ADPR/TRPM2-Systems wurde durch Untersuchungen zur Induktion der Apoptose durch hohe ConA-Konzentrationen nachgewiesen [4]. Zusammenfassend konnten mit dem entwickelten Verfahren intrazelluläre NAADP-Konzentrationen quantifiziert und damit eine wichtige Grundlage für die eingehende Untersuchung der Rolle dieses Nucleotids bei der Ca2+-Freisetzung in T-Lymphocyten geschaffen werden. Für ADPR wurde eine Funktion als sekundärer Botenstoff nachgewiesen, der nach Stimulation zur Aktivierung von TRPM2 führt, dadurch einen Einstrom von Ca2+ und Na+ bewirkt und so den Zelltod auslösen kann. Beide Teilprojekte dienten dazu, die bisherigen Modellvorstellungen zur Erzeugung von Ca2+-Signalen weiter auszubauen, um molekulare Ziele für die Entwicklung von Pharmaka zu identifzieren, die gezielt in diese Signalprozesse eingreifen könnten. Literatur: [1] I. Berg, B. Potter, G. Mayr, and A. Guse. Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP+) is an essential regulator of T-lymphocyte Ca2+-signaling. J Cell Biol, 150(3):581 8, 2000. [2] A.L. Perraud, H.M. Knowles, and C. Schmitz. Novel aspects of signaling and ion-homeostasis regulation in immunocytes. The TRPM ion channels and their potential role in modulating the immune response. Mol Immunol, 41(6-7):657 73, 2004. [3] A. Gasser and A.H. Guse. Determination of intracellular concentrations of the TRPM2 agonist ADPribose by reversed-phase HPLC. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 821(2):181 7, 2005. [4] A. Gasser, G. Glassmeier, R. Fliegert, M.F. Langhorst, S. Meinke, D. Hein, S. Krueger, K. Weber, I. Heiner, N. Oppenheimer, J.R. Schwarz, and A.H. Guse. Activation of T cell calcium influx by the second messenger ADP-ribose. epub ahead of print. J Biol Chem, 2005. [5] R.S. Lewis and M.D. Cahalan. Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul, 1(1):99 112, 1989.