In vitro and in silico studies of rational combination therapies against multidrug-resistant Gram-negative bacteria

Abstract

Antimicrobial resistance (AMR) poses a critical and escalating global threat, severely limiting the available options for treating infections caused by multidrug-resistant (MDR) Gram-negative bacteria, in particular those expressing carbapenemases or extended-spectrum beta-lactamases (ESBL). Consequently, the concept of rational combination therapies is receiving increasing emphasis as a means to maximize the efficacy of existing last-resort antibiotics, and alternative approaches, such as bacteriophage therapy. This thesis systematically investigated the pharmacokinetic and pharmacodynamic (PK/PD) properties of key last-resort and novel antimicrobials in vitro. The primary focus was on synergistic PD interactions against difficult-to-treat, MDR isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli. Integrating in vitro and in silico approaches, like various experimental and pharmacometric methods, this dissertation quantitatively evaluated the efficacy and interaction dynamics of meropenem-fosfomycin, ceftazidime/avibactam-tigecycline, polymyxin B and novel bacteriophage pK8—alone and in selected combinations. The work encompassed four foundational studies: Publication I PK/PD modelling of static and hollow-fibre infection model (HFIM) experiments of meropenem-fosfomycin combination therapy; Publication II Pharmacometric assessment of polymyxin B and bacteriophage pK8 combination against polymyxin-resistant K. pneumoniae; Publication III Systematic investigation of PD interactions between ceftazidime/avibactam and tigecycline in a panel of clinical and isogenic E. coli and K. pneumoniae isolates; and Publication IV The establishment of a pharmacometric framework to define rational combined clinical breakpoints for meropenem-fosfomycin combination therapy, employing data from a diverse MDR K. pneumoniae strain panel and multiple in vitro infection models. Quantitative analyses included static time-kill assays, checkerboard and ‘dynamic’ checkerboard methods, and longitudinal HFIM experiments simulating human PK profiles. In addition, nonlinear mixed-effects models and the General Pharmacodynamic Interaction Model were applied to elucidate not only efficacy endpoints but also the nature, directionality, and magnitude of drug interactions. Where appropriate, human population PK models informed simulation studies to translate in vitro findings into clinically meaningful guidance on dosing and probability of therapy success. The results demonstrated robust and reproducible synergy of meropenem-fosfomycin combination therapy across multiple MDR K. pneumoniae strains, including those producing KPC carbapenemases. PK/PD modelling confirmed that synergy was mainly driven by meropenem enhancing the potency of fosfomycin, resulting in profound suppression of bacterial regrowth that could not be achieved by monotherapies. These findings were validated in the HFIM using simulated human PK, confirming efficacy against resistant isolates and offering supportive evidence for clinical applicability. Building on these results, comprehensive simulations integrated diverse MDR K. pneumoniae strains, low to high dosing regimens, and two distinct dynamic in vitro infection models, allowing the proposal of rational, model-based clinical combined breakpoints. Notably, the meropenem-fosfomycin combination reliably achieved pharmacodynamic targets (Probability of Target Attainment ≥ 90% for bacteriostasis and 1-log reduction of bacteria) at substantially higher MICs than either compound alone (e.g., up to 32 mg/L | 512 mg/L for meropenem | fosfomycin), supporting both the reintroduction of an intravenous fosfomycin breakpoint in combination contexts and optimized dosing recommendations in severe MDR K. pneumoniae infections. A distinct strategy combining polymyxin B with a novel lytic bacteriophage (pK8) was explored against a polymyxin-resistant K. pneumoniae isolate. Pharmacometric modelling revealed a synergistic interaction characterized by phage-mediated resensitization to polymyxin B. Conversely, the systematic evaluation of ceftazidime/avibactam with tigecycline in clinical and isogenic E. coli and K. pneumoniae isolates revealed predominantly antagonistic PD interactions. Both checkerboard-based and time-kill assays, supported by metabolomic analyses, demonstrated that the maximal effect achieved in combination was limited to that of tigecycline monotherapy, suggesting not only lack of benefit but potential risk in this widely considered salvage regimen. This thesis demonstrates the value and necessity of integrating advanced pharmacometric modelling with state-of-the-art in vitro methodology to provide rational, quantitative evidence supporting or refuting specific combination strategies for MDR Gram-negative infections. Furthermore, the proposals for model-based clinical breakpoints, especially for meropenem-fosfomycin, represent a concrete advance toward rationalized, evidence-driven infectious diseases management amid the global AMR crisis. Prospective preclinical and clinical validation are now warranted to translate these findings into improved patient care, thereby maximizing the efficacy and safety of antibiotic therapy against MDR Gram-negative bacteria.

Antimikrobielle Resistenzen (AMR) stellen eine ernsthafte und zunehmende globale Bedrohung dar, die die verfügbaren Optionen zur Behandlung von Infektionen durch multiresistente (MDR) Gram-negative Bakterien, insbesondere solchen die Carbapenemases oder extended-spectrum beta-lactamases (ESBL) exprimieren, stark einschränken. Folglich erhält das Konzept rationaler Kombinationstherapien als Möglichkeit, die Wirksamkeit bestehender Reserveantibiotika zu maximieren, sowie alternative Ansätze wie die Bakteriophagentherapie, zunehmende Aufmerksamkeit. Ziel dieser Arbeit war es, die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen (PK/PD) Eigenschaften wichtiger Reserve- und neuartiger Antibiotika systematisch und in vitro zu charakterisieren. Der Fokus lag hierbei auf synergistischen PD-Interaktionen gegen schwer behandelbare, MDR Isolate von Klebsiella pneumoniae und Escherichia coli. Durch die Integration von in vitro- und in silico-Ansätzen, einschließlich verschiedener experimenteller und pharmkometrischer Methoden, wurde die Wirksamkeit und Interaktionsdynamik von Meropenem-Fosfomycin, Ceftazidim/Avibactam-Tigecyclin, und Polymyxin B und dem neuartigen Bakteriophagen pK8 – einzeln und in ausgewählten Kombinationen – quantitativ untersucht. Die Arbeit umfasste vier grundlegende Studien: Publikation I PK/PD-Modellierung von statischen und hollow-fibre infection model (HFIM) Experimenten zur Meropenem-Fosfomycin Kombinationstherapie; Publikation II Pharmakometrische Beurteilung der Kombinationstherapie von Polymyxin B und Bakteriophage pK8 gegen polymyxinresistente K. pneumoniae; Publikation III Systematische Untersuchung der PD-Interaktionen zwischen Ceftazidim/Avibactam und Tigecyclin in einer Auswahl klinischer und isogener E. coli und K. pneumoniae-Isolate; und Publikation IV Entwicklung eines pharmakometrischen Plattformmodel zur Definition kombinierter klinischer Breakpoints für die Meropenem-Fosfomycin-Therapie unter Nutzung von Daten aus einer vielfältigen MDR-K. pneumoniae Population und unterschiedlichen in vitro-Infektionsmodellen. Die quantitativen Analysen umfassten statische time-kill Methoden, checkerboard und dynamische checkerboard Methoden sowie longitudinale HFIM-Experimente zur Simulation humaner PK-Profile. Darüber hinaus wurden sog. nicht-lineare gemischte Effektmodelle und das General Pharmacodynamic Interaction Model angewendet, um neben der Wirksamkeit auch die Art, Richtung und das Ausmaß der Arzneistoffinteraktionen zu charakterisieren. Wo zutreffend, wurden humane PK-Populationsmodelle eingesetzt, um Simulationen zur Übertragung der in vitro Befunde in klinisch relevante Empfehlungen für Dosierung und Erfolgswahrscheinlichkeiten von Therapien zu erstellen. Die Ergebnisse zeigten eine robuste und reproduzierbare Synergie von Meropenem und Fosfomycin Kombinationstherapien über mehrere MDR K. pneumoniae-Stämme hinweg, einschließlich solcher mit Carbapenemases. Die PK/PD-Modellierung bestätigte, dass die Synergie hohe kombinierte Effekte erzeugte, die mit Monotherapien nicht erreicht werden konnten. Diese Ergebnisse wurden zusätzlich im Open Flow Infection Model und HFIM unter Einsatz simulierter humaner PK validiert, was die Wirksamkeit gegen resistente Isolate und klinische Anwendbarkeit bestätigte. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden umfassende Simulationen durchgeführt. Bemerkenswert ist, dass die Meropenem-Fosfomycin-Kombination die PD Zielwerte (Probability of Target Attainment ≥ 90 % für Bakteriostase und 1-log-Reduktion der Bakterien) bei weitaus höheren MIC-Werten als jede Einzelsubstanz (z.B. bis zu 32 mg/L | 512 mg/L für Meropenem | Fosfomycin) zuverlässig erreichte und sowohl die Wiedereinführung eines intravenösen Fosfomycin-Breakpoints im Kombinationskontext als auch optimierte Dosierungsempfehlungen bei schweren MDR K. pneumoniae-Infektionen unterstützt. Eine alternative Strategie untersuchte die Kombination von Polymyxin B mit einem neuartigen, lytischen Bakteriophagen (pK8) gegen ein polymyxinresistentes K. pneumoniae Isolat. Die pharmakometrische Modellierung zeigte eine synergistische Interaktion, gekennzeichnet durch Phagen-vermittelte Resensibilisierung gegenüber Polymyxin B und verstärkte bakterizide Effekte bei hoher Phagenzahl pro Bakterien. Umgekehrt zeigte die systematische Untersuchung von Ceftazidim/Avibactam mit Tigecyclin in klinischen und isogenen E. coli und K. pneumoniae-Isolaten überwiegend antagonistische PD-Interaktionen. Sowohl checkerboard-basierte als auch time-kill Untersuchungen, unterstützt durch metabolomische Analysen, belegten, dass der maximal erzielte Effekt in Kombination auf den von Tigecyclin-Monotherapie beschränkt war, was nicht nur fehlenden Nutzen, sondern möglicherweise potenzielle Risiken für dieses Therapie nahelegt. Diese Arbeit zeigt den Wert und die Notwendigkeit der Integration fortschrittlicher pharmakometrischer Ansätze mit modernen in vitro-Methoden, um rationale, quantitative Evidenz für oder gegen spezifische Kombinationsstrategien bei Infektionen ausgelöst durch MDR, Gram-negative Bakterien zu untersuchen.