Entwicklung eines optimierten Protokolls zur Kryokonservierung humaner Spermien zur Vermeidung verfahrensbedingter DNA-Schäden der Spermien

Abstract

Die Kryokonservierung von Spermien spielt eine wichtige Rolle in der modernen Fortpflanzungsmedizin, insbesondere bei der Erhaltung der männlichen Fertilität im Vorfeld potenziell gonadotoxischer Behandlungen oder im Kontext assistierter Reproduktionsverfahren. Während des Prozesses der Kryokonservierung der Spermienzellen besteht jedoch das Risiko funktionaler und struktureller Schäden, vor allem an der Spermien- DNA. Ziel dieser Doktorarbeit war es daher, ein verbessertes Verfahren zur Kryokonservierung von Ejakulaten zu entwickeln und herkömmliche Kryokonservierungsmedien hinsichtlich ihres protektiven Effektes zu vergleichen. Dazu wurden Ejakulate sowohl von gesunden Spendern als auch von Patienten mit Fertilitätsproblemen analysiert. Die Untersuchung befasste sich mit verschiedenen Zeiten zur Ejakulatverflüssigung und unterschiedlichen Methoden der Kryokonservierung von Ejakulaten (Slow Freezing / Rapid Freezing/ Vitrifikation mit oder ohne Kryoprotektivum), einschließlich des Vergleiches dreier herkömmlicher kommerzieller kryoprotektiver Medien. Die Integrität der Spermien-DNA wurde anhand des TUNEL-Assays und der AO-Färbung bewertet und durch herkömmliche Spermiogrammparameter, wie Beweglichkeit und Vitalität, ergänzt. Zur Auswertung der Färbungen wurde ein automatisiertes High Content Screening System (ScanR) verbessert, etabliert und schließlich angewendet. Die Untersuchungen zeigten, dass die Qualität der Spermien nach dem Einfrierprozess abnimmt: Motilität und Vitalität verringerten sich, während der DNA-Fragmentationsindex (DFI) anstieg - ein deutlicher Effekt sowohl bei den gesunden Probanden als auch bei den Patienten. Besonders signifikant war der Unterschied im DNA-Schadensprofil zwischen den beiden Gruppen: Während bei den Probanden hauptsächlich direkte DNA- Doppelstrangbrüche (TUNEL-Methode) festgestellt wurden, zeigte sich bei den Patienten durch ein hohes AO-Testergebnis insbesondere eine erhöhte Anfälligkeit des Chromatins (AO-Assay). Beim Vergleich der Kryomethoden erzielte die Verwendung des kontrollierten Slow-Freezing zusammen mit dem Eidotter-basierten Medium Test Yolk Buffer (TYB) signifikant bessere Ergebnisse mit den minimalsten Spermien-DNA-Schäden, der besten Spermienmotilität und der höchsten erhaltenen Vitalität. Außerdem zeigte sich eine Lagerung des Ejakulates von über 24 Stunden vor dem Einfrierprozedere nachteilig auf die Qualität der Spermien-DNA. Aus den Erkenntnissen wurde ein Verfahren entwickelt, das eine Auftauzeit von 30 bis 60 Minuten vorsieht und die Verwendung von TYB als kryoprotektives Medium sowie das Slow Freezing als bevorzugte Krykonservierungsmethode empfiehlt. Des Weiteren betont diese Arbeit die Relevanz des DFI im Bereich der männlichen Fertilitätsdiagnostik und die potenzielle Anwendung von künstlicher Intelligenz zur automatisierten Beurteilung der Qualität von Spermienzellen. Die fortgeschrittene Technologie des ScanR Systems ermöglicht eine präzisere und standardisierte Messung von Spermien-DNA-Schäden, was langfristig zu einer Verbesserung der herkömmlichen Analysemethoden führen könnte.