Tumorstroma des gastroösophagealen Adenokarzinoms: Einfluss von Makrophagen auf maligne gastroösophageale Epithelzellen

Abstract

Das gastroösophageale Adenokarzinom (GEAC) zählt zu den aggressivsten malignen Neo plasien des Gastrointestinaltraktes und ist mit einer äußerst ungünstigen Prognose verbunden. Aufgrund der biologischen Aggressivität werden etwa 65 % der Patienten erst in einem fortgeschrittenen, inoperablen oder metastasierten Stadium diagnostiziert, was trotz chirurgischer und endoskopischer Fortschritte zu einer 5-Jahres-Überlebensrate von unter 30 % führt. In diesen Stadien steht die palliative Therapie im Vordergrund. Ein wesentliches klinisches Problem stellt dabei die ausgeprägte primäre und erworbene Therapieresistenz des GEAC dar, deren molekulare Mechanismen bislang nur unzureichend verstanden sind. Die Identifikation neuer therapeutischer Zielstrukturen ist daher von hoher klinischer Relevanz. Etwa ein Drittel der GEAC-Patienten weist eine Überexpression des humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors 2 (HER2) auf, der als Zielstruktur für eine palliative zielgerichtete Therapie dient. Während die Phase-III-Studie To GA eine Verlängerung des Gesamtüberlebens durch die Kombination von Chemotherapie und Trastuzumab zeigen konnte, führte die Behandlung mit dem dualen EGFR/HER2 Tyrosinkinase-Inhibitor Lapatinib in der TRIO-013/LOGIC-Studie zu keiner relevanten Verbesserung des Gesamtüberlebens. Dieses fehlende Therapieansprechen verdeutlicht die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der zugrunde liegenden Resistenzmechanismen. Zahlreiche Studien belegen, dass das Therapieansprechen wesentlich durch die Tumormikroumgebung beeinflusst wird, die neben der extrazellulären Matrix auch Fibroblas ten, Endothelzellen und infiltrierende Immunzellen umfasst. Insbesondere für das GEAC ist gut belegt, dass Karzinogenese und Tumorprogression eng mit chronisch-entzündlichen Prozessen verknüpft sind. Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) stellen hierbei einen zentralen Bestandteil des Tumorstromas dar und können, abhängig vom Tumorstadium, die Tumorprogression, Invasion und Metastasierung fördern. Ihre Rolle bei der Vermittlung von Resistenzen gegenüber zielgerichteten Therapien im GEAC ist bislang jedoch unzureichend charakterisiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Untersuchung des Einflusses von Makrophagen auf die Tumorprogression sowie auf die Wirksamkeit der HER2-gerichteten Therapie im GEAC. Hierfür wurden zunächst cDNA-Transkriptome von 64 GEAC Patienten hinsichtlich onkogener Expressionsmustern analysiert. Darüber hinaus wurde mit Hilfe von Tissue-Mikroarray (TMA)-Analysen der Einfluss der Makrophagen auf klinisch-pathologisch Parameter untersucht. Anschließend wurden die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen in vitro mittels indirekter Kokultursysteme untersucht. Hierfür wurden die GEAC-Zelllinien PT1590, LN1590, NCI-N87, SKGT4, OE33 und PT6216 mit Makrophagen, die aus THP1-Monozyten und PBMCs hervorgegangen sind, kokultiviert. Diese erhobenen Befunde wurden anschließend erneut mit Hilfe des TMA verifiziert. Es zeigte sich zunächst, dass die makrophagenspezifischen Gene CD163, MSR1 und NOS2A signifikant höher in GEAC-Gewebe exprimiert werden, als im gesunden Kontrollgewebe. Insbesondere GEAC-Patienten, die durch eine hohe Expression dieser Gene charakterisiert waren, zeigten Expressionsmuster, die mit einer erhöhten Tumorprogression und Therapieresistenz assoziiert sind. Darüber hinaus war eine hohe Infiltration CD163- und CD68-positiver Makrophagen mit einem höheren Tumorstadium, einer gesteigerten Proliferation, dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen, einer stärkeren Dedifferenzierung und einem reduzierten Gesamtüberleben verbunden. In der indirekten Kokultur der GEAC Zellen mit den THP1- und MDM-Makrophagen konnte bestätigt werden, dass insbesondere die HER2-positiven PT1590-, LN1590- und NCI-N87-Zellen unter dem Einfluss der Makrophagen eine erhöhte Proliferation aufwiesen. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die HER2-positiven Zelllinien PT1590 und NCI-N87 in Anwesenheit der Makrophagen einen nahezu vollständigen Wirkverlust gegenüber dem TKI Lapatinib aufwiesen. Dabei zeigte sich begleitend eine verstärkte Aktivierung der onkogenen Signaltransduktionswege STAT3, AKT und ERK. Insbesondere eine starke STAT3-Aktivierung war unter Lapatinibtherapie und Makrophagenkokultur nachzuweisen. Ein siRNA-vermittelter Knockdown von STAT3 konnte die Zellen gegenüber Lapatinib wieder sensibilisieren, jedoch die Makrophagen-vermittelte Proliferation nicht aufheben. In einer weiteren Sekretom Analyse konnte PDGF-AA als differenziell sekretierter Faktor der Makrophagen identifiziert werden. Die Stimulation der GEAC-Zelllinie PT1590 mit PDGF-AA führte zu einer erhöhten Proliferation, Lapatinib-Resistenz und zu einer Aktivierung der Signalwege STAT3, AKT und ERK. Durch Neutralisierung des PDGF-AA und durch pharmakologische Inhibition sowie siRNA-vermittelten Knockdown des PDGFRα konnten die Makrophagen-induzierte Proliferation und Lapatinib-Resistenz wieder aufgehoben werden. Darüber hinaus konnte durch die Hemmung des PDGFRα die Makrophagen-vermittelte AKT- und ERK-Aktivierung reduziert werden, während die STAT3-Aktivierung erhalten blieb. Diese Befunde wurden mittels cDNA-Transkriptomanalyse und TMA bestätigt. Dabei zeigte sich zunächst eine deutlich erhöhte Expression von PDGFA und PDGFRA im GEAC-Gewebe im Vergleich zum Kontrollgewebe. Diese Expression korrelierte dabei mit der Expression der makrophagenspezifischen CD68 und CD163. Zusätzlich konnte mittels RNAScope-Analyse nachgewiesen werden, dass intratumorale CD68-positive Makrophagen PDGFA exprimieren. Insbesondere in den Bereichen mit ausgeprägter Makrophageninfiltration konnte eine starke membranöse PDGFRα-Phosphorylierung nachgewiesen werden. Diese Aktivierung des PDGFRα konnte mit einem erhöhten Tumorstadium und einem reduzierten Gesamtüberleben von GEAC-Patienten korreliert werden. Zusätzlich zeigte sich ein Zusammenhang zwischen der Höhe des Serum-PDGF-AA und einem fortgeschrittenen Tumorstadium. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit erstmals, dass tumorinfiltrierende Makrophagen über die Freisetzung von PDGF-AA und die Aktivierung eines PDGFRα/AKT/ERK-Signalwegs wesentlich zur Tumorprogression und zur Resistenz gegenüber der HER2-gerichteten Therapie im GEAC beitragen. Eine kombinierte Inhibition von HER2 und PDGFRα könnte daher insbesondere für HER2-resistente GEAC-Patienten eine vielversprechende therapeutische Strategie darstellen