Binding properties determine the cytoadhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes with the host

Abstract

The pathogenicity of Plasmodium falciparum malaria is primarily driven by the sequestration of infected erythrocytes in the microvasculature, mediated by the interaction between P. falciparum erythrocyte membrane protein1 (PfEMP1)and various host human endothelial cell receptors (ECRs). Investigating the distinct adhesion properties of the approximately 60 different PfEMP1 variants encoded by the var gene family has historically been hindered by the parasite’s ability to switch the actively presented PfEMP1 and the heterogeneity of in vitro cultures. This study characterized transgenic IT4 parasite lines, generated via the selection linked integration (SLI) system, to link specific genotypes to adhesive phenotypes under static and flow conditions. Adhesion assays of the SLI-activated parasite lines to ECRs presented on transgenic Chinese hamster ovary cells confirmed known receptor interactions for several PfEMP1s. Known binding partners for IT4var01-HAendo and IT4var16-HAendo such as CD36 and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) were confirmed, along with the identification of novel binding partners. Flow chamber assays using the IT4var01-HAendo line revealed distinct binding dynamics, characterized by rolling adhesion on CD36 and static adhesion on ICAM-1. The placental malaria-associated variant, IT4var04-HAendo (VAR2CSA), demonstrated known cytoadhesion to chondroitin sulfate A (CSA), however, additionally a novel, broadly unspecific binding to all tested Chinese hamster ovary (CHO) cells was observed as well. Conversely, the investigation of more complex variants presented significant challenges. The severe malaria-associated candidate IT4var19-HAendo initially lacked expected endothelial protein C receptor (EPCR) binding, which could only be induced by multiple rounds of binding enrichment. Subsequently, static adhesion was observed to EPCR and ICAM-1, with the latter contradicting earlier descriptions of var19 as an EPCR-only binder. Furthermore, attempts to characterize the A-type IT4var08-HAendo and the expected EPCR-binder IT4var20-HAendo revealed genomic plasticity and transcriptional instability of theses two transgenic parasite lines. RNA-seq analysis indicated that IT4var08-HAendo cultures did not maintain the SLI mediated mutually exclusive expression of the IT4var08 target gene, while IT4var20-HAendo formed three potential fusion genes with var27. The discovery and initial characterization of the mutually exclusive expression defective phenotype of IT4var08-HAendo provided a promising tool to further study the complex mechanisms of var gene switching. The transcriptomic analysis of a large set of IT4 lines of different var expression patterns revealed novel insights into coexpression of var-adjacent genes, based on relative gene orientation. Finally, the study utilized the earlier characterized multi-binding IT4var01-HAendo line to screen synthetic peptide libraries derived from CD36 and ICAM-1 binding domains for their ability to inhibit cytoadhesion to these to ECRs. While identifying potential inhibitory candidates, such as the CD36-derived peptides P03CD36 and P05CD36, the screening revealed significant cytotoxicity and hemolysis-related artefacts, highlighting the complexity of peptide-based interference strategies. Only one peptide, P07CD36, out of the ten peptides each tested to inhibit CD36 and ICAM-1 cytoadhesion, showed a moderate binding inhibition of 15% relative to the non-inhibited positive control. These findings demonstrate the utility of SLI-based systems for characterizing specific var expression while underscoring the substantial impact of genomic recombination, transcriptional switching, and compound toxicity on experimental validation.

Die Pathogenität der Plasmodium falciparum-Malaria wird maßgeblich durch die Sequestrierung von P. falciparum-infizierten Erythrozyten (iEs) in den Kapillaren bestimmt, welche durch die Interaktion zwischen P. falciparum erythrocyte membrane protein1(PfEMP1) und verschiedenen menschlichen Wirtsendothelzellrezeptoren (ECRs) vermittelt wird. Die Untersuchung der unterschiedlichen Adhäsionseigenschaften der ca. 60 verschiedenen PfEMP1-Varianten, kodiert durch die var-Genfamilie, wurde bislang durch die Fähigkeit des Parasiten zum Wechsel der präsentierten PfEMP1, sowie durch die Heterogenität deren Expression in in vitro-Kulturen erschwert. In dieser Studie wurden transgene IT4-Parasitenlinien charakterisiert, die mittels des selection linked integration (SLI)-Systems generiert wurden, um spezifische Genotypen unter statischen und Flussbedingungen mit adhäsiven Phänotypen zu verknüpfen. Adhäsionsassays der SLI-aktivierten Parasitenlinien an ECRs, präsentiert auf transgenen CHO-Zellen, bestätigten bekannte Rezeptorinteraktionen für mehrere PfEMP1s. So konnten für IT4var01-HAendo und IT4var16-HAendo Bindungspartner wie CD36 und intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) verifiziert sowie neue Bindungspartner identifiziert werden. Flusskammer-Assays der IT4var01-HAendo Linie zeigten distinkte Bindungsdynamiken, charakterisiert durch rollende Adhäsion auf CD36 und statische Adhäsion auf ICAM-1. Die mit plazentarer Malaria assoziierte Variante IT4var04-HAendo (VAR2CSA) wies die bekannte Cytoadhäsion an chondroitin sulfate A (CSA) auf, zeigte darüber hinaus jedoch auch eine neue, breit unspezifische Bindung an alle getesteten CHO-Zellen. Die Untersuchung komplexerer Varianten stellte hingegen eine größere Herausforderung dar. Der mit schwerer Malaria assoziierte Kandidat IT4var19-HAendo zeigte anfänglich nicht die erwartete endothelial protein C receptor (EPCR)-Bindung, diese konnte erst durch mehrfache Bindungsanreicherung induziert werden. Anschließend ließ sich eine statische Adhäsion an EPCR und ICAM-1 beobachten. Letztere widerspricht früheren Beschreibungen von var19 als reinem EPCR-Binder. Des Weiteren offenbarten Versuche zur Charakterisierung der Linien IT4var08-HAendo und IT4var20-HAendo eine genomische Plastizität und transkriptionelle Instabilität im Parasitengenom. RNA-Seq-Analysen deuteten darauf hin, dass IT4var08-HAendo-Kulturen die durch SLI vermittelte, gegenseitig ausschließende Expression des IT4var08-Zielgens nicht aufrechterhielten, während IT4var20-HAendo drei potenzielle Fusionsgene mit var27 bildete. Die Entdeckung und erste Charakterisierung des mutually exclusive expression defective (MEED)-Phänotyps von IT4var08-HAendo lieferte ein vielversprechendes Werkzeug, um die komplexen Mechanismen der PfEMP1-Expression weiter zu untersuchen. Eine transkriptomische Analyse einer großen Anzahl an IT4-Linien mit unterschiedlichen var-Expressionsmustern gab zudem neue Einblicke in die Koexpression von var-benachbarten Genen in Abhängigkeit ihrer relativen Genorientierung. Abschließend wurde die zuvor charakterisierte, multibindende IT4var01-HAendo-Linie genutzt, um synthetische Peptidbibliotheken, abgeleitet von CD36-und ICAM-1 Bindungsdomänen, auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Cytoadhäsion an diese ECRs zu prüfen. Zwar wurden potenzielle inhibitorische Kandidaten wie die CD36-abgeleiteten Peptide P03CD36 und P05CD36 identifiziert, jedoch enthüllte das Screening auch signifikante Zytotoxizität und Artefakte durch Hämolyse, was die Komplexität peptidbasierter Bindungsinhibition verdeutlicht. Von den jeweils zehn getesteten Peptiden zur Hemmung der CD36- und ICAM-1-Cytoadhäsion zeigte lediglich P07CD36 eine moderate Bindungshemmung von 15% relativ zur nicht-inhibierten Positivkontrolle. Diese Ergebnisse demonstrieren den Nutzen SLI-basierter Systeme zur Charakterisierung spezifischer var-Expression, unterstreichen jedoch gleichzeitig den erheblichen Einfluss von genomischer Rekombination, transkriptionellem Umschalten und Substanztoxizität auf die experimentelle Validierung.