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Titel: Untersuchungen zur Struktur und Funktion von ClC-K und Barttin
Sprache: Deutsch
Autor*in: Marnitz, Tim
Schlagwörter: ClC; ClC-K; Barttin; Signalmotiv; Fusionsprotein; chloride channel; ClC; ClC-K; Barttin; Bartter syndrome
GND-Schlagwörter: Ionenkanal; Chloridkanal; Untereinheit; Bartter-Syndrom; Heterologe Genexpression; Proteintransport; Clathrin; Ubiquitin; Endocytose
Erscheinungsdatum: 2005
Tag der mündlichen Prüfung: 2006-06-06
Zusammenfassung: 
Das Bartter-Syndrom Typ IV mit den Leitsymptomen des renalen Salzverlusts und sensorineuraler Taubheit konnte auf Mutationen im BSND-Gen zurückgeführt werden, welches für Barttin kodiert. Barttin dient als funktionelle Untereinheit der ClC-K-Kanäle, die der Familie der spannungsabhängigen Chloridkanäle angehören, und steigert im Xenopus-laevis-Oozyten-System die Leitfähigkeit sowie die Oberflächenexpression der ClC-K-Kanäle.

Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der funktionellen Einheit aus ClC-K und Barttin.

Im ersten Teil der Arbeit sollte die Frage geklärt werden, ob Barttin als funktionelle Untereinheit lediglich indirekter Regulator der ClC-K-Kanäle ist, oder ob eine direkte Interaktion beider Partner, evtl. auch an der Zelloberfläche, stattfindet. Hierzu wurden Fusionsproteine von ClC-K/Barttin, bestehend aus ClC-K, einem Peptid-Bindeglied und Barttin bzw. Abschnitten von Barttin, verwendet. Die Oberflächenexpression der Fusionsproteine nach Expression in Xenopus-laevis-Oozyten konnte mittels eines Oberflächenassays nachgewiesen werden. Barttin ist somit bei direkter Interaktion mit ClC-K in der Lage, dieses an die Zelloberfläche zu führen. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Voltage-Clamp-Ströme der Fusionsproteine aus ClC-K und Barttin sich entsprechend verhalten, wie ClC-K nach Koexpression mit Barttin. Diese Beobachtungen geben einen starken Hinweis auf eine direkte Interaktion von ClC-K und Barttin an der Zelloberfläche. Die Funktionalität der Fusionsproteine deutet auf eine äquimolare Stöchiometrie der Proteine im Komplex hin. Aufgrund von Western-Blot-Analysen, bei denen Dimere der Fusionsproteine detektiert wurden, könnte im Kanalkomplex ein Verhältnis von zwei Molekülen ClC-K zu zwei Molekülen Barttin vorliegen.
Konstrukte, die ClC-K und lediglich den zytoplasmatischen, C-terminalen Abschnitt von Barttin enthalten, unterscheiden sich weder elektrophysiologisch noch in ihrer Oberflächenexpression von ClC-K. Diese Beobachtung zeigt die wichtige Funktion der N-terminalen Transmembrandomänen von Barttin und verdeutlicht, dass Signale im C-terminalen Abschnitt von Barttin allein nicht ausreichen, um ClC-K zu aktivieren.

Im zweiten Teil der Arbeit sollten Mechanismen, die an der Regulation der Oberflächenexpression von ClC-K/Barttin beteiligt sein könnten, untersucht werden. Barttin besitzt ein mutmaßliches PY-Motiv im Bereich des Tyrosinrests Y98, über das eine Ubiquitin-abhängige Internalisierung der Oberflächenkomplexe aus ClC-K und Barttin stattfinden könnte. Kompetitionsexperimente mit WW-Domänen verschiedener Ubiquitinligasen, die die Bindung einer endogenen Ligase an das beschriebene Motiv verhindern sollten, zeigten im Oozyten-System keinen Hinweis auf einen solchen Regulationsmechanismus. Darüber hinaus wurde eine Beteiligung von Tyrosin-basierten Sortierungsmotiven sowie Dileucinmotiven an der Regulation von Barttin untersucht, die durch Interaktion mit Adapterkomplexen zu einer Clathrin-assoziierten Endozytose der Proteine führen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sowohl die Mutation eines Dileucin-Motivs in Barttin als auch eine Deletion der Barttin-Region Y98-L132 zu einer Erhöhung der ClC-K-Ströme führt. Die deletierte Region umfasst neben dem Dileucin-Motiv auch das Tyrosin Y98, das als zentraler Anteil des oben erwähnten PY-Motivs überlappend auch Teil eines Tyrosin-basierten Sortierungssignals sein kann. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigen, dass eine gezielte Regulation der Oberflächenexpression des Komplex’ aus ClC-K und Barttin über Adapterkomplexe stattfindet.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/1406
URN: urn:nbn:de:gbv:18-29663
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Jentsch, Thomas J. (Prof. Dr. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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