Signaltransduktion durch den humanen Transmembranrezeptor SorLA

Abstract

In der Arbeit wurden Wege der Signaltransduktion durch den humanen Typ-I-Transmembranrezeptor SorLA untersucht. SorLA stellt aufgrund seiner Domänenverteilung ein Bindeglied zwischen der Familie der „Low Density Lipoprotein Rezeptoren“ und der Familie der Rezeptoren mit einer Vps10-Domäne dar. Es spielt eine Rolle beim Transport des Amyloiden Vorläuferproteins und vermindert dessen Prozessierung zu der pathogenen Komponente der Alzheimer Krankheit, dem Amyloid-beta-Peptid (Abeta). Ebenso wie das Amyloide Vorläuferprotein unterliegt SorLA einer sequentiellen Proteolyse durch eine Alpha- und eine Gamma-Sekretase, wobei letztere einen Schnitt innerhalb der Transmembrandomäne katalysiert und die Intrazellulärdomäne (SorICD) ins Zytoplasma entlässt. Die in vitro-Freisetzung der SorICD durch eine Aktivität der Gamma-Sekretase wurde in dieser Arbeit in speziellen Anreicherungsexperimenten nachgewiesen. Weiterhin wurde die Translokalisation der SorICD in den Zellkern untersucht. Da die freigesetzte SorICD, wie ebenfalls in dieser Arbeit nachgewiesen, rasch durch das Insulin-degradierende Enzym abgebaut wird, war nur an EGFP fusionierte SorICD in der Immunfluoreszenz direkt nachweisbar. Es konnte gezeigt werden, dass SorICD als EGFP-Fusionsprotein in der Lage ist, in den Zellkern zu gelangen. In diesem Zusammenhang wurde ein System etabliert, mit dem die Fluoreszenz des EGFP direkt in SDS-Gelen untersucht werden kann. Die oben beschriebene sequentielle Proteolyse von SorLA kann durch die Bindung des Neuropeptides Kopfaktivator ausgelöst werden. Somit unterliegt SorLA einer regulierten Intramembranproteolyse. Ob die Bindung von Kopfaktivator zusätzlich eine Phosphorylierungskaskade innerhalb von SorLA-exprimierenden Zellen auslöst, wurde mit Hilfe von zweidimensionaler Gelelektrophorese untersucht, führte aber zu keinem positiven Resultat. Eine bereits postulierte mitogene Wirkung von Kopfaktivator auf diese Zellen konnte per Doppelbestimmung von DNA-Gehalt und mitose-spezifisch-phoshoryliertem Histon H3 in der Durchflusszytometie und mittels eines indirekten Proliferationsversuchs mit alamarBlue nicht bestätigt werden. In weiteren Versuchen wurden EGFP-Multimere, deren Molekulargewichte über dem Diffusionslimit in den Kern liegen, auf ihre Eignung als Fusionspartner für Kernloka-lisationsstudien geprüft. Hintergrund war die Tatsache, dass monomeres EGFP auch ohne Fusionspartner im Kern zu finden ist. Ein tetrameres EGFP zeigte dagegen eine schwächere Kern- als Zytoplasmalokalisation und eignet sich daher besser als monomeres EGFP für zukünftige Kernlokalisationsstudien.