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Titel: Molekulare Charakterisierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen LmxMPK11 und LmxMPK12 aus Leishmania mexicana
Sonstige Titel: Molecular Characterisation of the Mitogen-activated Proteinkinases LmxMPK11 and LmxMPK12 from Leishmania mexicana
Sprache: Deutsch
Autor*in: Windelberg, Mareike
GND-Schlagwörter: Leishmania mexicana; MAP-Kinase
Erscheinungsdatum: 2006
Tag der mündlichen Prüfung: 2007-05-02
Zusammenfassung: 
Die LmxMPK11 und die LmxMPK12 sind MAP-Kinasen-homologe Proteine in Leishmania mexicana. Die Gene beider Kinasen konnten vollständig sequenziert werden und im bakteriellen Expressionssystem exprimiert werden. Ferner konnten Deletionsmutanten erzeugt, und mit diesen eine in-vitro-Differenzierung durchgeführt werden.
Die LmxMPK11 ließ sich im GST-Expressionssystem mit einer hohen Ausbeute aufreinigen und zeigte im in-vitro-Aktivitätstest eine starke Auto- und MBP ( Myelin Basic Protein) Phosphorylierungsaktivität bei einer leichten Präferenz für Mn2+-Ionen. Durch Austausch einer Aminosäure in dem aktiven Zentrum konnte eine inaktive Mutante hergestellt werden, die im Kinase-Aktivitätstest keine Aktivität zeigte.
Beide Allele des single copy-Gens LmxMPK11 konnten über gezielte homologe Rekombination durch Resistenzgene ersetzt werden. Somit ist die LmxMPK11 für das Wachstum der Promastigoten in vitro nicht essentiell. Die Deletion des LmxMPK11-Gens führt jedoch zu einer Wachstumsverlangsamung der Promastigoten im Vergleich zum Wildtyp und hat auch einen deutlichen Einfluß auf die Differenzierung zu Amastigoten, deren Teilungsvermögen bei den Deletionsmutanten stark eingeschränkt war. Bei der mikroskopischen Betrachtung waren morphologisch keine Unterschiede auszumachen.
Mit Hilfe eines polyklonalen Antikörpers gegen die LmxMPK11 konnte sowohl bei der in-vitro-Differenzierung von Promastigoten zu Amastigoten, als auch bei der Differenzierung von Amastigoten aus der Mausläsion zu Promastigoten gezeigt werden, dass die LmxMPK11 in allen Stadien exprimiert wird.
Bei der Infektion von BALB/c-Mäusen mit den Deletionsmutanten zeigten 2/3 der Mäuse keine Läsionsbildung, die übrigen eine stark verzögerte und verlangsamte Entwicklung. Daraus lässt sich schließen, dass die LmxMPK11 auch einen deutlichen Einfluss auf die Differenzierung von Amastigoten in vivo hat. Die episomale Komplementation führte zu einer Reexpression der LmxMPK11.
Die LmxMPK12 ließ sich nur schwer exprimieren und zeigte nur eine sehr schwache Aktivität im in-vitro-Kinasetest. Auch die LmxMPK12 erwies sich als nicht essentiell für das Wachstum von Promatigosten in vitro und morphologisch waren bei den Deletionsmutanten keine Unterschiede zum Wildtyp zu erkennen.
Doch bei der in-vitro-Differenzierung zeigte sich, dass auch die LmxMPK12 einen starken Einfluss auf das Teilungsvermögen von Amastigoten hat, die nach der Differenzierung nicht weiter wuchsen.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/1742
URN: urn:nbn:de:gbv:18-33107
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Fleischer, Bernhard (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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